碳酸氫鈉聯合超聲波對羊肉嫩度及其肌動球蛋白含量的影響

時海波，諸永志,2，陳曉，張新笑，姜迪，徐平平，鄒燁*，王道營*，徐為民

1(江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京，210014)2(青海湖肉業有限責任公司，青海 海南州，813000) 3(江蘇省科學技術情報研究所，江蘇 南京，210000)

嫩度是一種重要的肉質性狀，本質上，肉品嫩度決定于內在因素，如結締組織的數量和溶解度、肌纖維在僵直過程中的肌節縮短以及宰后肌原纖維和肌纖維相關的蛋白分解(鈣蛋白酶類及組織蛋白酶類)[1]。超聲波作為一種綠色、高效的新型嫩化方法，其機械、空化效應可快速破壞肉品結構，加速肌肉僵直期，從而達到肉品短時促嫩效果[2-4]。過往磷酸鹽類常用于肉品嫩度改善和提高保水性能，但過量添加會表現出金屬味，并且攝入過多對人體有一定傷害，而碳酸鹽的功效歸因于其溶解肌纖維蛋白和增強靜電排斥作用的能力，NaHCO3作為一種常見的無磷食品添加劑，可提高產品多汁性、整體適口性、減少蒸煮損失和剪切力來提高肉制品的營養質量，有效改善產品嫩度[5-6]。然而，關于NaHCO3聯合超聲波處理在嫩化肉類中的應用尚未被報道，因此，本研究采用NaHCO3聯合超聲波處理新鮮羊肉，分析其對羊肉嫩度及肌動球蛋白含量的影響，以期為快速高效地解決肉類嫩度這一首要肉品工業問題提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊肉，江蘇蘇食食品有限公司(南京)；預染寬范圍標準蛋白，加拿大Fermentas公司；各試劑均為分析純，南京建成生物工程研究所有限公司；羊肉剔除表面結締組織和肌膜后，待用。

1.2 儀器與設備

超聲波細胞破碎儀，寧波新芝；C-LM-3B型數顯式肌肉嫩度儀，東北農業大學工程學院；HH-4數顯恒溫水浴鍋，常州國華；TVT-300XP質構儀，瑞典TexVol；ZQZY-75BS振蕩培養箱，北京乾明；UniCenMR臺式冷凍離心機，英國Herolab；HI-9025酸度計，意大利Hanna；EVO-LS10掃描電鏡，德國ZEISSE Oberkochen；多功能酶標儀，美國Biotek。

1.3 方法

1.3.1 樣品的預處理

將大小、薄厚均勻的同批次羊肉切成40 mm×40 mm×20 mm矩形塊(50±3)g。隨機選取做以下處理：C組，不做任何處理，4 ℃放置1 h；W組，去離子水4 ℃浸泡1 h；W+U組，去離子水浸泡1 h后超聲處理5 min(400 W，20 kHz)；S組，0.2 mol/L NaHCO3浸泡1 h；S+U組，0.2 mol/L NaHCO3浸泡1 h后超聲處理(同上)。其中，去離子水與NaHCO3溶液用量均為500 mL(1 000 mL燒杯，完全淹沒樣品)，各組平行3次試驗。

1.3.2 羊肉浸泡前后浸泡液pH、質量、粗蛋白測定

采用手持HI-9025酸度計測定羊肉浸泡前后浸泡液的pH值；鑒于浸泡液質量變化占比微小且不易稱量，故以肉塊質量變化反推，處理完后，肉塊置于燒杯上方(圖1)自然滴定表面殘余水分30 min，并準確稱量浸泡前后肉塊質量變化(結果保留小數點后2位)；粗蛋白含量測定采用考馬斯亮藍法(結果保留小數點后3位)。

圖1 浸泡液質量損失測定裝置Fig.1 Device of mass loss of soaking solution

1.3.3 肉品pH測定

取1.3.1處理后羊肉2 g，剁成肉糜，置于100 mL離心管中(含18 mL去離子水)，攪拌均勻后用手持HI-9025酸度計測定pH值，測定3次取均值。

1.3.4 蒸煮損失的測定

根據YANG等[7]方法并略作修改，肉塊蒸煮前擦拭肉塊表面水分后稱重，記為m1。數顯溫度計插入肉塊中央(順肌纖維方向)，置于7號自封袋內并封口，85 ℃恒溫水浴加熱至中心溫度75 ℃后立即取出，流水冷卻至室溫25 ℃，擦拭表面水分后稱重，記為m2。由公式(1)計算蒸煮損失率：

(1)

1.3.5 質構特性的測定

采用物性測定儀質構剖面分析(TPA)模式測定羊肉質構特性。將處理后的羊肉切成1 cm3方塊，測試速率為1 mm/s，觸發力5 g，形變量50 %，探頭型號為P/75。測試6次取均值。

1.3.6 剪切力的測定

取1.3.4處理后肉塊，用鐵直尺與手術刀順肌纖維方向切割成30 mm×10 mm×10 mm肉柱，肌肉嫩度儀垂直肌纖維方向剪切，測定5次取均值。

1.3.7 肌原纖維小片化指數(myofibril fragmentation index,MFI)

參考HOPKINS等[8]方法并作適當的修改：2 g羊肉糜加20 mL MFI提取緩沖液(0.1 mol/L KCl，l mmol/L NaN3，l mmol/L MgCl2，20 mmol/L K2HPO4，l mmol/L EGTA，pH 7.1，4 ℃)，12 000 r/min冰浴均質(30 s/次，2次)，冷凍離心(12 000×g，15 min)。重復上述步驟后于沉淀中加入15 mL MFI緩沖液，混勻，過雙層紗布，濾液為肌原纖維蛋白溶液。考馬斯亮藍試劑盒測定其濃度，酶標儀測定540 nm處吸光度(調節質量濃度至0.5 g/L)。由公式(2)計算MFI值：

MFI=OD540×200

(2)

1.3.8 肉品持水力測定

離心法測定羊肉持水力[9]。三層濾紙包裹肉樣，置于50 mL離心管，10 000×g冷凍離心10 min，記錄離心前后肉塊質量分別為m1與m2。由公式(3)計算持水力：

(3)

1.3.9 超微結構分析

掃描電鏡(scanning electron microscopy，SEM)測定羊肉微觀結構。薄片肉樣大小為3 mm× 3 mm× 2 mm(順肌纖維方向切片)，3 %戊二醛固定，乙醇梯度洗脫后冷凍干燥、噴金鍍膜，觀察超微結構。

1.3.10 組織切片分析

羊肉處理后切成5 mm厚小塊，3 %戊二醛固定后做石蠟切片，染色脫水后鏡檢分析。

1.3.11 肌動球蛋白的提取

參考OKITANI等[10]方法并作微調：2 g肉糜加20 mL Weber溶液(0.6 mol/L KCl，0.04 mol/L NaHCO3，0.01 mol/L Na2CO3，pH 7.2)，12 000 r/min冰浴勻漿(30 s/次，2次，間停20 s)。勻漿液搖床振蕩20 h(200 r/min，4 ℃)，過2層紗布除去羊肉筋膜等不溶物。調整濾液中KCl濃度為0.2 mol/L后繼續振蕩1 h，經冷凍離心(15 000×g，20 min)后取沉淀。沉淀溶解于KCl-Tris溶液(0.02 mol/L Tris-HCl，0.6 mol/L KCl，pH 7.2)，即為肌動球蛋白溶液。BCA法測定其濃度，并稀釋至1.0 g/L，待用。

1.3.12 肌動球蛋白SDS-PAGE凝膠電泳測定

取1.3.11稀釋后的肌動球蛋白60 μL，加15 μL上樣緩沖液(5×)，干式恒溫器95 ℃滅酶10 min，12 000×g離心3 min。取上清進行電泳分析，每孔等體積上樣5 μL，蛋白Marker(10 ～180 kDa)作對照，泳槽中緩慢倒入1 L電泳緩沖液，先于電流16 mA下電泳15 min，后32 mA下電泳60 min。結束后，考馬斯亮藍R-250染色15 min，脫色后成像分析。

1.4 數據處理

試驗均3次重復，SPSS 24.0統計軟件進行數據分析，Origin 8.0繪制圖表，兩組間數據分析采用Turkey檢驗，P<0.05，表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 羊肉浸泡前后浸泡液pH、質量、粗蛋白變化

由表1可知，未超聲組(W組，S組)浸泡液pH前后差異不顯著，且略有降低，這是由于本實驗組羊肉pH低于去離子水與NaHCO3的pH，肉塊中少許成分與去離子水、NaHCO3置換引起。對比超聲組，可見S+U組pH略有上升，NaHCO3浸泡后液體pH變化較小，超聲空化效應與機械效應促進組織內鹽溶性蛋白滲出，同時也促進組織液滲出，由于NaHCO3溶液pH遠高于肉塊組織pH，混勻后液體pH依舊略有提高，而W+U組因去離子水pH與肉塊pH相差并不大，組織液經超聲滲出后，致使浸泡液pH略有下降，但仍與單獨去離子水處理差異不大。浸泡液質量變化可由肉塊質量變化反映，表中除W組變化不顯著，其余組肉塊質量均有所提高(即浸泡液質量均有所損失)，超聲處理破壞了肌原纖維蛋白，肉品組織結構變得松軟，促進了浸泡液滲透，肉塊吸收液體能力增強，NaHCO3呈弱堿性，對肉塊具有腐蝕性，對纖維組織具有軟化作用，兩者協同效果更加明顯。粗蛋白含量經考馬斯亮藍試劑盒測定，超聲組均較未超聲組有所提高，驗證了超聲處理對蛋白的溶出作用。

表1 浸泡液pH、質量、粗蛋白變化Table 1 Changes of pH, mass, crude protein ofsoaking solution

注：同指標同列數據肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 羊肉肉糜pH變化

宰后肌肉pH變化反映其糖原酵解速率與乳酸生成量關系，動物宰殺后因氧氣供應中斷，嗎肌糖原無氧酵解生成乳酸，而成熟期pH升高，肉質嫩度得到改善[11]。

如圖2所示，各處理組pH值均處于宰后僵直成熟期pH范圍(5.8 ～ 6.5)。與C組相比，W組與W+U組羊肉pH值均升高，即偏中性去離子水浸泡使偏酸性羊肉pH略有上升，但差異不明顯，這可能歸因于超聲引起的“水波震動”及“注水滾揉嫩化”[12]，但兩者均與S+U組差異顯著(P<0.05)。與C組相比較，S組和S+U處理組較未處理組羊肉pH顯著升高，范圍在0.5～1.0，且2種嫩化方法均較對照組差異顯著(P<0.05)，S+U組羊肉pH最大，嫩化效果最好，這與張坤等[13]結果相似。宰后肌肉pH值下降引起肌漿網和鈣泵功能改變，導致細胞內鈣濃度增加、肌肉僵硬[14]，而超聲可促進肌動球蛋白解離,加快糖酵解進程,羊肉pH顯著升高。另一方面可能因為NaHCO3溶于水呈弱堿性，羊肉pH上升。且高pH保持時間越長，利于鈣蛋白酶的活性提高，羊肉嫩度得以改善[15]。NaHCO3、超聲波均能改善肉品嫩度，兩者聯合效果更為明顯。

圖2 NaHCO3和超聲處理對羊肉pH的影響Fig.2 Effects of sodium bicarbonate andultrasound treatments on pH of lamb注：C-未處理組；W-去離子水浸泡1 h；W+U-去離子水浸泡1 h后超聲處理；S-碳酸氫鈉浸泡1 h；S+U-碳酸氫鈉浸泡1 h后超聲處理。不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.3 羊肉肉塊蒸煮損失變化

如圖3所示，未處理組羊肉肉塊蒸煮損失明顯高于其他處理組。單獨去離子水處理雖較未處理組有顯著性差異，但效果不如NaHCO3，且W+U組與S+U組的差異明顯(P<0.05)。S+U組在加熱蒸煮過程中損失最低，較未處理組降低了18 %，具有良好的保水效果，說明超聲波處理可降低肉塊的蒸煮損失率，提高肉塊的保水性，這可能是由于超聲破壞了細胞原有結構，胞內Ca2+外流，鈣激活酶被激活，肌原纖維蛋白分解加快，使羊肉嫩度增大、肉質變嫩[16]。超聲處理促進鹽溶性蛋白向羊肉的表面大量集中，鹽溶性蛋白含量的多少與蒸煮加熱后蛋白形成的凝膠有關，含量越高，凝膠結構越致密，束縛的水分越多，超聲處理增大了羊肉肉塊表面阻止水分向外面擴散的能力[17]；與此同時，NaHCO3處理顯著降低了羊肉蒸煮損失率，優于單獨去離子水浸泡，這與李楠等[18]結論一致(NaHCO3的添加顯著降低了PSE雞胸肉與正常雞胸肉的蒸煮損失)。NaHCO3聯合超聲波處理效果最優。

圖3 NaHCO3和超聲處理對羊肉蒸煮損失的影響Fig.3 Effect of sodium bicarbonate and ultrasound treatments on cooking loss of lamb

2.4 羊肉質構特性變化

由圖4可知，經單獨去離子水處理的肉塊，其咀嚼性、內聚性、膠著性與未處理組差異不顯著(P>0.05)，W組肉塊表面色澤稍有變化，但去離子水不易滲入組織纖維內部，對質構影響不大。與未處理組相比，W+U組和S+U組各項質構參數有顯著差異(P<0. 05)，即超聲促進去離子水與NaHCO3滲入組織內部，較好地改善了羊肉品質。此外，W+U組與S+U組、W組與S組兩兩差異顯著，說明NaHCO3

較去離子水浸泡嫩化效果更好，聯合超聲可進一步增強該效果。對照組硬度較其余處理組均明顯偏大，而W+U組與S+U組也有差異，說明超聲處理對羊肉的硬度影響較大，可改變肉品嫩度。與JAYASOORI-YA等[19]發現超聲處理降低牛肉剪切力和硬度、提高其質構和改善牛肉品質的結論相符。GOT等[20]對牛肉塊進行超聲處理，其肌間Ca2+釋放較對照組提高30 %，即超聲不僅破壞肌纖維，對細胞/細胞膜也存在影響，促使Ca2+提前釋放至肌細胞間隙。此外，超聲處理亦可拉伸肌節長度，提高肉品嫩度。另外，NaHCO3呈堿性，對于肉品有一定的腐蝕性，可能會破壞羊肉的結構和肌原纖維，有效地改善了肉品的質構特性和嫩度，符合2.1所述推測，NaHCO3聯合超聲波處理對羊肉質構效果顯著。

A-咀嚼型；B-內聚性；C-膠著性；D-硬度圖4 NaHCO3和超聲處理對羊肉質構的影響Fig.4 Effect of sodium bicarbonate and ultrasound treatments on texture properties of lamb

2.5 羊肉剪切力變化

由圖5可知，經NaHCO3、NaHCO3聯合超聲波、去離子水聯合超聲波處理的羊肉剪切力均較未處理組有顯著減小(P<0.05)，W組剪切力變化不大，而S+U組剪切力最小，即NaHCO3聯合超聲波處理對羊肉嫩化效果最好，與JAYASOORIYA等[19]發現超聲波處理可以降低牛肉的剪切力結論一致。這可能是由于超聲波機械效應物理破壞肌纖維蛋白，空化作用破壞其線粒體和溶酶體膜等，大量鹽溶蛋白與嫩化酶釋放，一定程度上促進了鹽溶蛋白富集于肉塊表面，從而引起羊肉嫩度改善[21]。這與朱秋勁等[22]結論相似(新鮮牛肉經超聲處理可促進蛋白酶分泌，游離氨基酸含量增加，組織結構改變，從而改善嫩度)。NaHCO3呈堿性，影響蛋白結構，兩者聯合處理使蛋白空間立體性增加，高級結構改變，提高了羊肉嫩度品質[23]。

圖5 NaHCO3和超聲處理對羊肉剪切力的影響Fig.5 Effect of sodium bicarbonate and ultrasound treatments on shear force of lamb

2.6 羊肉肌原纖維小片化指數(MFI)變化

由圖6可知，未處理組肌原纖維小片化指數較其他處理組差異明顯(P<0.05)，且W+U組與S+U組之間也存在顯著差異，說明碳酸氫鈉嫩化效果優于去離子水，且超聲處理可增大羊肉的嫩度。其中S+U組MFI顯著大于其他組，且較未處理組提高近1倍，說明NaHCO3聯合超聲波處理效果最佳。在宰后肌肉中，鈣蛋白酶激活，引起Z盤相關肌原纖維蛋白降解，造成肌纖維斷裂[24]。MFI是表現肌原纖維斷裂程度的參數，也是表征肉品嫩度的重要指標，MFI值與肌原纖維斷裂程度及肉品嫩度成正比，與剪切力值變化息息相關。所以可推斷，超聲波的空化效應和穿透性導致羊肉肌原纖維和結締組織被破壞，肌原纖維小片化程度加快，MFI增大。另一方面，NaHCO3可使羊肉軟化，肌原纖維斷裂，變成肌節小片，MFI增大，故NaHCO3聯合超聲波處理的效果最佳。

圖6 NaHCO3和超聲處理對羊肉MFI的影響Fig.6 Effect of sodium bicarbonate and ultrasound treatments on MFI of lamb

2.7 羊肉肉品持水力變化

肌肉持水力與肉品嫩度和食用品質密切相關，肌肉蛋白中起保水性、黏著性的是肌纖維中的肌球蛋白(含量最高，也最重要)[25]。研究發現，肌肉系水力與其蛋白含量呈正相關[26]。值得注意的是，蛋白變性與肉品持水力有直接關系，變性引起結構松馳，組織間隙變大，持水性增強。如圖7所示，S+U組肉品

持水力明顯高于C組和W+U組(P<0.05)，W+U組和C組存在差異，但不顯著(P>0.05)。可能是因為超聲改變了肉品中蛋白質的含量，間接影響了肉品的持水力。這與SIRO等[27]結論相似(適宜頻率和強度的超聲波可改變肌肉組織微觀結構，提高持水性)。此外，肉品pH值影響持水力大小，當pH大于或小于蛋白質等電點時，肌肉發生松弛，改變肉品的持水力，碳酸氫鈉為弱堿，會增大肉品的pH，適當地增大持水力，這與2.1中浸泡液質量損失、肉品吸水性能增加具有較好的一致性，因此，NaHCO3聯合超聲波處理的肉品持水力最佳。

圖7 NaHCO3和超聲處理對羊肉肉品持水力的影響Fig.7 Effect of sodium bicarbonate and ultrasound treatments on holding water capacity of lamb

2.8 羊肉超微結構變化

由圖8可知，未處理組羊肉纖維緊密、嚴實，表面平整光滑，沒有裂縫和空洞。W+U組羊肉肌原纖維進一步地變大，纖維之間開始出現裂縫、少許空洞以及輕微的斷裂。S組與S+U組羊肉肌原纖維的結構斷裂明顯，空間和結構變得疏松和細碎，表面空洞明顯，促進了羊肉的嫩化，這是因為超聲引起空化氣泡積聚在樣品表面后爆裂引起微射流，導致樣品表面結構沖蝕、可溶性物質釋放[28]。超聲波可以破壞羊肉的肌原纖維和結締組織，增大肉品嫩度，碳酸氫鈉可以軟化肌原纖維和降解肌肉蛋白質，使纖維更易斷裂，兩者聯合改善嫩度效果最好。

A～E-C、W、W+U、S、S+U(300×)；F～J-C、W、W+U、S、S+U(1 000×)圖8 不同處理組羊肉的掃描電鏡圖Fig.8 The scanning electron microscopy photographs of lamb under different treatments

2.9 羊肉組織切片變化

圖9為各處理組羊肉組織橫、縱切面圖，未處理組羊肉肌原纖維束完整，纖維間間隙較小，排列緊密，無破壞跡象。單獨去離子水處理對羊肉組織切片影響不大，W+U組的肌原纖維因經去離子水浸泡后超聲處理促進水分進入而有輕微的增大，由縱切面可以觀察到間隙稍增大，部分纖維束不完整，遭到一定程度的破壞。S+U組的肌原纖維斷裂程度最大，間隙最大，且在間隙中可觀察到細胞內容物的釋放，肌纖維結構斷裂片段大小不一，超聲機械與空化效應導致細胞中的內容物包括蛋白酶等物質釋放到纖維間隙，組織蛋白酶的活性被激活增大，肌原纖維斷裂明顯[29]。NaHCO3由于自身呈堿性，對肉品具有一定的腐蝕作用，協助超聲波加重羊肉肌原纖維破壞斷裂。肌纖維的斷裂和纖維間隙的增大對于羊肉的嫩化有較大的促進作用，去離子水聯合超聲波對肌纖維的斷裂有一定的效果，而碳酸氫鈉聯合超聲波處理對于肉品的嫩化效果最佳，進一步證實了上述肌纖維小片化指數結論。

A-未處理組的橫截面； B-去離子水處理組的橫截面；C-去離子水聯合超聲波處理組的橫截面；D-NaHCO3處理組的橫截面；E-NaHCO3聯合超聲波處理組的橫截面；F～J-分別為各處理組對應的縱截面圖9 羊肉組織肌原纖維橫切圖和肌原纖維縱切圖Fig.9 Tissue section of lamb

2.10 肌動球蛋白SDS-PAGE凝膠電泳結果分析

電泳圖難以表征肌原纖維蛋中肌球蛋白(大分子質量蛋白，約510 kDa)，但肌動蛋白為小分子質量蛋白(約43 kDa)，在SDS-PAGE凝膠電泳試驗中可以常規寬分子質量Marker作為參比，操作相對簡便，故常以肌動蛋白含量表征肌動球蛋白解離情況[30]。

圖10為各組羊肉肉塊中提取的肌動球蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖，各處理組之間的蛋白條帶均完整，沒有出現碎條帶，說明超聲波、NaHCO3、去離子水均未破壞蛋白的亞基組成。不同處理組之間的肌動球蛋白條帶粗細、深淺不一，有顯著的差別。S+U組的肌動蛋白條帶最粗，且和C組、W+U組差異顯著，肌動蛋白含量最高。這可能是由于弱堿性NaHCO3起到降解肌動球蛋白作用，肌動蛋白游離，表現為肌動蛋白條帶增粗，同時超聲處理會破壞細胞膜和細胞基本結構，細胞的內容物包括組織蛋白酶和鈣蛋白酶等被釋放，作用于羊肉肉品，進一步改善羊肉嫩度，這也與質構特性、剪切力等指標的結論一致。

圖10 羊肉肌動球蛋白的SDS-PAGE圖Fig.10 Sodium dodecyl sulfate-gel electrophoresis patterns of actomyosin in lamb

3 結論

本試驗對未處理和經去離子水、NaHCO3及對應的超聲波聯合處理的羊肉進行對比分析，結果表明，NaHCO3聯合超聲波處理可增大羊肉的pH、加速宰后成熟期、降低蒸煮損失和剪切力，其質構參數變化顯著，嫩度增大，肉質得以改善。同時羊肉的肌原纖維小片化指數(MFI)增大，持水力增強，提高了肉制品的質量和食用價值。NaHCO3聯合超聲波處理可使羊肉表面的某些微觀結構發生顯著的改變，肌原纖維出現不同程度的斷裂和軟化，纖維間間隔增大、肉質疏松，肌動球蛋白經NaHCO3聯合超聲波處理后，其微環境改變，游離態肌動蛋白的含量升高。但仍需驗證該聯合處理對羊肉嫩度與肌動球蛋白解離的關系、優化復合嫩化參數，并對處理后羊肉感官風味品質、營養流失等作進一步的分析，以及從肌球蛋白(肌原纖維中最重要的蛋白)著手研究NaHCO3聯合超聲波嫩化羊肉機理，為改善畜禽類肉品品質提供新的方向和方法。