從藏靈菇中篩選高抗氧化能力乳酸菌

肖宇，李鍵，周鉞，明玉蓮，周芳，劉士健，索化夷*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715) 2(西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都，610041)

生物機(jī)體的氧化作用(physiological oxidation)，是機(jī)體代謝過(guò)程中產(chǎn)生的羥自由基、過(guò)氧化氫等活性氧與蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)等發(fā)生的氧化反應(yīng)。人體年齡增加的同時(shí)，自由基清除機(jī)制的平衡更易被打破，當(dāng)活性氧含量超過(guò)一定量，細(xì)胞膜、酶類、核酸等物質(zhì)遭受破壞，導(dǎo)致細(xì)胞功能受損等問(wèn)題，從而引起心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病[1]。人體可通過(guò)膳食攝入抗氧化物質(zhì)，提高機(jī)體抗氧化能力，達(dá)到一定程度的抗衰老作用，然而化學(xué)抗氧化劑尚存安全隱患，在人體內(nèi)富集達(dá)到一定量將損害人體正常機(jī)能。目前國(guó)內(nèi)天然抗氧化劑種類較少，主要為茶多酚、VC、迷迭香等，且適用范圍較窄，分別主要用于果蔬飲料，茶味制品，膨化食品中[2]。乳酸菌主要抗氧化成分為抗氧化多肽，是一種新型的天然抗氧化劑，成本較低且可快速獲得[3-5]。找到高抗氧化活性的乳酸菌，對(duì)乳制品等領(lǐng)域天然抗氧化劑的開(kāi)發(fā)有重要意義。

藏靈菇又名“西藏雪蓮”,是西藏林芝地區(qū)傳統(tǒng)酸奶的發(fā)酵劑，其形似一種白色膠質(zhì)狀顆粒，具有復(fù)雜多樣的菌相結(jié)構(gòu)，富含各種菌種資源[6-7]。研究表明，藏靈菇以乳酸菌、醋酸菌及酵母菌為優(yōu)勢(shì)菌群，其中乳酸菌具有較高的抗氧化活性[8-18]。從中篩選出抗氧化活性較強(qiáng)的乳酸菌，對(duì)于豐富擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高抗氧化菌種資源庫(kù)，開(kāi)發(fā)具有高抗氧化能力的酸乳飲品有積極意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

藏靈菇，來(lái)源于西藏牧民家庭，保存于西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院；商業(yè)乳酸菌發(fā)酵劑，川秀商用酸奶發(fā)酵劑、安琪酸奶發(fā)酵劑；MRS培養(yǎng)基，美國(guó)BD公司；1，2-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)(分析純)，美國(guó)Sigma公司；無(wú)水乙醇，分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司；鐵氰化鉀、三氯乙酸、FeCl3、硫代巴比妥酸、FeSO4、鄰苯三酚、抗壞血酸，均為分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)；細(xì)菌DNA提取試劑盒，生化試劑，北京索萊寶科技有限公司；2×Taq PCR Master Mix、引物1492R、27F，生化試劑，天根生化(北京)科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

5804R離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；Eynergy H1酶標(biāo)儀，上海生工生物工程公司；S1000 Thermal Cycler梯度PCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司；BX53F電子生物顯微鏡，日本OLYMPUS公司；Y92-IIDN超聲波細(xì)胞破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌分離純化與鑒定

參考文獻(xiàn)[17-19]進(jìn)行菌種分離，將藏區(qū)采集的14份藏靈菇用篩網(wǎng)濾出，投入冷卻的滅菌全脂乳，置于28 ℃培養(yǎng)24 h左右，至全脂乳凝固。繼代培養(yǎng)后，取1 mL凝乳加入9 mL無(wú)菌生理鹽水中，以10倍濃度梯度逐次稀釋，取10-4、10-5、10-6濃度的100 μL稀釋液進(jìn)行MRS固體培養(yǎng)基涂布。37 ℃培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行平板劃線，直到平板上為單菌落分布。挑取單菌落涂布于載玻片，進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，觀察記錄純化后的菌落形態(tài)。挑取單菌落至MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃水浴搖床培養(yǎng)48 h，取1.5 mL培養(yǎng)液，按照細(xì)菌DNA提取試劑盒的操作步驟提取DNA。將剩余培養(yǎng)液封口，4 ℃保存?zhèn)溆谩⒖嘉墨I(xiàn)[8]的DNA提取物PCR擴(kuò)增體系和操作步驟，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物送檢華大基因，得到的測(cè)序結(jié)果在Gene Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST序列比對(duì)分析。

1.2.2 乳酸菌培養(yǎng)及胞外提取物的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[8]，修改如下：按1%的比例將乳酸菌培養(yǎng)液接入MRS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h，混勻培養(yǎng)液，4 ℃、6 000 r/min離心15 min，倒掉上清液，加入PBS緩沖液(0.02 mol/L，pH=7.4)，混勻，再以上述離心條件進(jìn)行離心，倒掉上清液。此清洗步驟重復(fù)3次，得到菌體細(xì)胞。加入PBS緩沖液，充分混勻，調(diào)節(jié)菌液濃度為1.0×109CFU/mL(OD600=1.0)。將菌液分為2組，一組為完整細(xì)胞組，另一組進(jìn)行超聲破碎(變幅桿φ6，開(kāi)1 s，關(guān)2 s，功率33%，時(shí)間15 min)，4 ℃、10 000 r/min離心15 min，顯微鏡檢查沒(méi)有完整細(xì)胞，收集上清液作為無(wú)細(xì)胞提取物組。

1.2.3 乳酸菌對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[8]所述方法，將待測(cè)樣品與DPPH自由基無(wú)水乙醇混合均勻，避光反應(yīng)30 min，離心后取上清液，測(cè)定其在517 nm處的吸光度。VC具有抗氧化能力，且抗氧化能力隨濃度增大而變強(qiáng)。以0～0.40 g/L不同質(zhì)量濃度VC溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，測(cè)定DPPH自由基清除率，并轉(zhuǎn)換為VC當(dāng)量。

1.2.4 乳酸菌對(duì)超氧陰離子清除能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[9]所述方法，Tris-HCl中加入二乙三胺五乙酸、鄰苯三酚和待測(cè)樣品，25 ℃水浴反應(yīng)10 min后測(cè)定在325 nm處的吸光度，以VC為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.5 乳酸菌還原能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[10]所述方法，混勻待測(cè)樣品、PBS緩沖溶液和鐵氰化鉀溶液，50 ℃反應(yīng)后加入三氯乙酸，離心后取上清液，與蒸餾水、FeCl3溶液等體積混合，測(cè)定700 nm下的吸光值，以VC為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.6 乳酸菌抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[8]所述方法，將待測(cè)樣品、PBS緩沖溶液、亞油酸乳化液和FeSO4溶液混合，37 ℃水浴反應(yīng)1.5 h后，加入三氯乙酸溶液和硫代巴比妥酸溶液，100 ℃反應(yīng)30 min后置于冰浴中，離心，收集上清液測(cè)其在532 nm處的吸光度，以VC為陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.7 發(fā)酵乳的4種抗氧化能力測(cè)定

選取抗氧化能力較強(qiáng)的8株乳酸菌，以及2種普通商用發(fā)酵劑(安琪發(fā)酵劑組記作A1，川秀發(fā)酵劑組記作A2)，按照0.2%的比例接入滅菌乳(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，105 ℃滅菌15 min)中，37 ℃培養(yǎng)4 h左右，直到其pH=4.6，終止發(fā)酵。混勻酸乳，用滅菌超純水將其稀釋5、10、15倍3個(gè)濃度梯度，利用上述4種抗氧化能力測(cè)定方法測(cè)定。對(duì)照組A0滅菌乳中添加0.2%的超純水，稀釋倍數(shù)為5、10、15倍。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 24.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素ANOVA檢驗(yàn)，用Duncan多范圍檢驗(yàn)比較組內(nèi)差異，用Origin pro 9.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的篩選鑒定

所有菌株的DNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)雙向測(cè)序，獲得的序列經(jīng)SeqMan軟件拼接后，通過(guò)BLAST在Gene Bank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)同源性，同源率98%以上的為有效結(jié)果。結(jié)果表明，與Gene Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知菌株比較，80株菌中，59株有100%的同源性，14株有99.93%的同源性，4株有99.92%的同源性，99.79%，99.65%，99.86%同源性的菌株各有1株。總結(jié)80株乳酸菌的16S rDNA序列鑒定結(jié)果，如表1所示。菌株M22的菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果，如圖1所示。

本研究從14份藏靈菇中分離純化得到80株乳酸菌，共鑒定得到30株開(kāi)菲爾乳桿菌(占總菌數(shù)37.5%)，9株植物乳桿菌(占總菌數(shù)11.3%)，7株保加利亞乳桿菌(占總菌數(shù)8.8%)，3株干酪乳桿菌(占總菌數(shù)3.8%)，5株假腸膜明串珠菌(占總菌數(shù)6.3%)，26株耐久腸球菌(占總菌數(shù)32.3%)。開(kāi)菲爾乳桿菌和耐久腸球菌是藏靈菇的主要乳酸菌。

A-菌落形態(tài)；B-革蘭氏染色圖1 M22菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果(1 000×)Fig.1 Colony morphology and gram staining results of M22

表1 80株菌16Sr DNA序列鑒定結(jié)果Table 1 Identification of 80 strains by 16S rDNA sequences

2.2 乳酸菌抗氧化能力比較

2.2.1 選擇菌株

所分離鑒定到的80株細(xì)菌中有49株乳酸菌可以在食品中使用，選用49株乳酸菌里在MRS液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較快的36株，將其編號(hào)為M1～M36。

2.2.2 乳酸菌DPPH自由基清除能力的測(cè)定

乳酸菌的DPPH自由基清除率如表2所示，36株乳酸菌中有16株乳酸菌的完整細(xì)胞組DPPH自由基清除率>15%，在16株菌中，有2株干酪乳桿菌，1株保加利亞乳桿菌，13株開(kāi)菲爾乳桿菌。其中開(kāi)菲爾乳桿菌抗氧化活性較高，M23、M33完整細(xì)胞的DPPH自由基清除能力較強(qiáng)，分別為32.95%、29.75%，開(kāi)菲爾乳桿菌M30無(wú)細(xì)胞提取物清除率為22.39%，顯著高于其他菌株(P<0.05)。在其他研究者的類似研究中也發(fā)現(xiàn)乳酸菌對(duì)DPPH自由基清除率高活性區(qū)間在18%～33%[8,10]。

2.2.3 乳酸菌對(duì)超氧陰離子清除能力的測(cè)定

由表3可知，共有17株乳酸菌的完整細(xì)胞組對(duì)超氧陰離子的清除能力高于16%，其中有4株植物乳桿菌，6株保加利亞乳桿菌，7株開(kāi)菲爾乳桿菌。開(kāi)菲爾乳桿菌活力最強(qiáng)，完整細(xì)胞組菌株M31顯著高于其他組，為43.21%，無(wú)細(xì)胞組菌株M22超氧陰離子清除率最高，為21.83%。36株乳酸菌的完整細(xì)胞組和無(wú)細(xì)胞組都有一定的超氧陰離子清除能力。

表2 乳酸菌對(duì)DPPH自由基的清除率Table 2 DPPH free radical scavenging activity of lactic acid bacteria

注：表中數(shù)據(jù)為36株菌中菌體細(xì)胞DPPH自由基清除率>15.00%的菌株，共16株。表中不同小寫(xiě)字母代表差異顯著，P<0.05。下同。

表3 乳酸菌對(duì)超氧陰離子自由基的清除率Table 3 Superoxide anion scavenging activity of lactic acid bacteria

注：表中數(shù)據(jù)為36株菌中完整細(xì)胞超氧陰離子自由基清除率>16.00%的菌株，共17株。

2.2.4 乳酸菌還原能力的測(cè)定

如表4所示，有16株乳酸菌的完整細(xì)胞組還原能力高于30%，其中有1株干酪乳桿菌，3株植物乳桿菌，3株保加利亞乳桿菌，9株開(kāi)菲爾乳桿菌。其中各類乳酸菌還原能力差別不明顯，菌株M14，M35，M2的完整細(xì)胞組和無(wú)細(xì)胞組具有較高的還原力，顯著高于其他菌株，其中保加利亞乳桿菌M14的完整細(xì)胞組和無(wú)細(xì)胞組具有最高的還原力，分別為67.82%和61.88%。

表4 乳酸菌的還原能力Table 4 Reducing powder of lactic acid bacteria

注：表中數(shù)據(jù)為36株菌中完整細(xì)胞還原能力>30.00%的菌株，共16株。

2.2.5 乳酸菌抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力的測(cè)定

由表5可知，共有17株菌的完整細(xì)胞組抗脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率高于23%，其中有1株干酪乳桿菌，6株植物乳桿菌，10株開(kāi)菲爾乳桿菌。開(kāi)菲爾乳桿菌抗氧化活性最強(qiáng)，完整細(xì)胞組M22抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力最高，為45.97%，其余完整細(xì)胞組抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力相對(duì)較弱。無(wú)細(xì)胞組M30具有最高的抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力，為35.85%，菌株M22，M27，M35對(duì)抗脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制率也高于30%。

研究測(cè)定乳酸菌4種方法的抗氧化能力，結(jié)果顯示，不同菌株的抗氧化能力有所差異，同一菌株4種方法下的抗氧化能力高低不一致。在表2～表5中，所測(cè)4種乳酸菌在4種測(cè)定方法下，開(kāi)菲爾乳桿菌株數(shù)分布較均勻，菌株M23、M31、M14、M22分別在4個(gè)方面的抗氧化能力突出，故選擇包括另外4株抗氧化能力較高的菌株M11、M2、M30、M35進(jìn)行乳酸發(fā)酵，并測(cè)定4種方法的抗氧化活性。

2.3 發(fā)酵乳抗氧化能力比較

如圖2～圖5所示，乳酸菌的發(fā)酵乳對(duì)DPPH自由基的清除率M31組最高，對(duì)超氧陰離子自由基的清除率M31組最高，2種測(cè)定方法組內(nèi)沒(méi)有顯著性差異。在發(fā)酵乳的還原力方面，M35、M14、M2組顯著高于其他組；在抗脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率的方面，M30、M22顯著高于其他組。在4個(gè)方面抗氧化能力的測(cè)定中，A0組都低于其他組，說(shuō)明在發(fā)酵之后，牛奶的抗氧化活性提高，在4種方法的測(cè)定中，具有較高抗氧化能力的發(fā)酵乳對(duì)應(yīng)的乳酸菌，同樣具有對(duì)應(yīng)測(cè)定方面的較高抗氧化活性。

表5 乳酸菌對(duì)抗脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制率Table 5 Inhibitory rate of lactic acid bacteria on lipperoxidation

注：表中數(shù)據(jù)為36株菌中完整細(xì)胞抗脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率>23.00%的菌株，共17株。

圖2 發(fā)酵乳的DPPH自由基清除率Fig.2 DPPH free radical scavenging activity of fermented milk

圖3 發(fā)酵乳對(duì)超氧陰離子自由基的清除率Fig.3 Superoxide anion scavenging activity of fermented milk

圖4 發(fā)酵乳的還原力Fig.4 Reducing powder of fermented milk

圖5 發(fā)酵乳對(duì)抗脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制率Fig.5 Inhibitory rate of fermented milk on lip peroxidation

3 結(jié)論

本研究從14份藏靈菇樣品中篩選出了80株乳酸菌，包括30株開(kāi)菲爾乳桿菌、9株植物乳桿菌、7株保加利亞乳桿菌、3株干酪乳桿菌、5株假腸膜明串珠菌和26株耐久腸球菌。對(duì)其中36株乳酸菌進(jìn)了4個(gè)方面的抗氧化活性的測(cè)定，結(jié)果顯示，完整細(xì)胞組M23、M31、M14、M22，破碎細(xì)胞組M30、M22、M14、M30分別在DPPH自由基清除能力、對(duì)超氧陰離子清除能力、還原能力、抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力最高，分別為32.96%、44.49%、67.82%、45.97%和22.39%、21.83%、61.88%、35.85%。從36株菌中選用不同方面抗氧化能力較強(qiáng)的8株乳酸菌，進(jìn)行酸奶發(fā)酵，并測(cè)定了發(fā)酵乳稀釋5、10、15倍后的抗氧化能力，與未發(fā)酵乳、商用發(fā)酵劑的發(fā)酵乳對(duì)比，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵乳抗氧化能力顯著高于未發(fā)酵組，其中還原力和抗脂質(zhì)過(guò)氧化抑制能力較高的菌株發(fā)酵乳抗氧化性顯著高于商用發(fā)酵劑的發(fā)酵乳。最終確定菌株M30、M14具有最優(yōu)的抗氧化能力，在乳酸發(fā)酵后使發(fā)酵乳具有較高抗氧化活性。

在篩選出的菌株中，耐久腸球菌、開(kāi)菲爾乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌。假腸膜明串珠菌、耐久腸球菌在食品安全方面尚存在爭(zhēng)議[20-21]，在其他關(guān)于藏靈菇菌種分離鑒定的研究中也多有發(fā)現(xiàn)，可能是經(jīng)人體進(jìn)入了藏靈菇的菌系中。乳酸菌細(xì)胞的抗氧化活性與細(xì)胞中的抗氧化物質(zhì)有關(guān)，這使得不同菌株細(xì)胞抗氧化能力不同。在測(cè)定了抗氧化能力的菌株中，開(kāi)菲爾乳桿菌抗氧化活性最強(qiáng)，在完整細(xì)胞組和無(wú)細(xì)胞提取物組的最高抗氧化能力菌株中，菌株M14為保加利亞乳桿菌，其余4株菌都為開(kāi)菲爾乳桿菌。開(kāi)菲爾乳桿菌作為藏靈菇的優(yōu)勢(shì)菌并具有較高的抗氧化活性，在藏靈菇抗氧化等多種活性功能[22]中發(fā)揮作用。根據(jù)數(shù)據(jù)可知，同一菌株在4種方法下抗氧化能力高低并無(wú)相關(guān)性，則是由于不同條件下的抗氧化機(jī)理不同。細(xì)胞破碎后其抗氧化能力降低，是由于一部分抗氧化結(jié)構(gòu)變性失去活力，但其還具備的活性是否與其細(xì)胞壁中的多糖成分有關(guān)，還有待進(jìn)一步研究。經(jīng)過(guò)發(fā)酵后酸乳較牛乳抗氧化活力得到極大提高，其原因在抗氧化菌株的增殖本身增加了抗氧化活性，其發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生了代謝產(chǎn)物，如抗氧化肽。高抗氧化活力乳酸菌的篩選和抗氧化功能性酸乳的生產(chǎn)是酸乳市場(chǎng)細(xì)分的一個(gè)方向。