L-半胱氨酸對鮮切紫甘薯護色保鮮作用

馮程程，于筠，王春玲

(天津科技大學 食品工程與生物技術學院，天津，300457)

甘薯是一種旋花科(牽牛花)的雙子葉植物[1]，因其營養和促進健康的價值而被廣泛種植[2]，是繼水稻、小麥、馬鈴薯、玉米和木薯之后最重要的糧食作物[3]。紫甘薯為甘薯中的一種，其具有高水平的酰化花色素苷和其他酚類物質[4-5]，還含有豐富的維生素、礦物質、膳食纖維和碳水化合物[6]。隨著人們對健康生活的追求，紫甘薯因其較高的營養價值獲得了大眾的青睞。然而，紫甘薯切割后呼吸消耗加劇，代謝反應增強，營養品質迅速下降，尤以因切割操作引起的酶促褐變反應的不良問題，嚴重影響了產品外觀和營養價值，直接導致貨架期的縮短，因此，研發出一種適用于鮮切紫甘薯的保鮮技術是極為重要的。

SGROPPO等[7]發現用檸檬酸調節pH至2.91的2%偏亞硫酸氫鈉溶液浸泡鮮切甘薯，可以較好地減少鮮切甘薯貯藏過程中顏色的變化，延長其貨架期。趙嫚等[8]研究表明用0.4%植酸、0.6%L-賴氨酸、0.2%殼聚糖、0.3%菠蘿酶復合處理鮮切甘薯可以有效抑制鮮切甘薯的酶促褐變。劉碩等[9]發現用5%抗壞血酸鈣+0.03%ε-聚賴氨酸復合液浸泡鮮切甘薯能夠有效降低鮮切甘薯貯藏期間的褐變度和菌落總數。目前，雖然國內外有部分對鮮切甘薯的護色保鮮研究，但基本停留在有關色度和褐變度等感官方面指標的測定，對于鮮切甘薯貯藏過程中營養物質的變化，以及影響褐變的幾種相關酶的研究較少。加之紫甘薯與其他甘薯相比富含花青素的特殊性，找到一種簡單有效且具有針對性的保鮮技術十分重要。

L-半胱氨酸(L-cysteine，L-cys) 是組成蛋白質的20種氨基酸之一,屬于脂肪族氨基酸[10]，有較好的褐變控制能力。L-半胱氨酸控制鮮切果蔬褐變的機理有多種說法[11-15]。

本實驗利用0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 g/L，五種不同質量濃度的L-cys溶液浸泡紫甘薯，與蒸餾水處理組比較，測定各項理化指標以及褐變相關酶活性，研究L-cys對于延緩鮮切紫甘薯的褐變效果，確定一種簡單合理的的鮮切紫甘薯加工工藝參數方法，延長貨架期，為紫甘薯的護色保鮮提供參考，以期為鮮切紫甘薯產品的開發提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用的紫甘薯品種為紫羅蘭，購于天津金元寶農貿市場。挑選大小基本一致、無機械傷和病蟲害的新鮮紫甘薯。L-cys(食品級)，浙江多味化工食品有限公司；乙醇、濃HCL、福林酚試劑(分析純)，天津市天工化工廠；無水Na2CO3(分析純)，天津市化學試劑一廠；醋酸鈉、乙酸：分析純，天津市北洋第一化工廠；愈創木酚、鄰苯二酚(HPLC≥98%)，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

CPA電子分析天平，德國Sartorius公司；SCOUT SE式電子天平，美國OHAUS公司；DZ-400 2F型真空包裝機，大江機械設備有限公司；SC-10精密色差儀，深圳市三恩馳科技有限公司；GY-4數顯式水果硬度計，艾德堡儀器有限公司；L550型離心機，湘儀離心機儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋，鄭州長城工貿有限公司；MULTISKAN GO酶標儀，美國Thermo公司；紫外可見分光光度計，美國Thermo公司；FE20/EL20型pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；制冰機，日本SANYO公司

1.3 實驗方法

1.3.1 試樣處理

實驗前用體積分數75%的乙醇對所有試驗用具進行滅菌處理。將原料經200 μL/L的次氯酸鈉溶液浸洗2 min后，用蒸餾水沖洗干凈，用紗布擦干后，快速削皮，切成5 mm厚的紫甘薯片，放于配制的不同質量濃度L-半胱氨酸溶液中浸泡15 min，取出瀝干，真空包裝后置于4 ℃冰箱中儲存。

通過預實驗感官評價確定鮮切紫甘薯在4 ℃儲存條件下，12 d后表面顏色差，褐變現象明顯,商品性狀逐漸喪失，逐漸出現腐爛，失去商品價值。因此選定共測量12 d，每隔48 h測定1次指標。每個指標重復測定3次，結果取平均值。L-cys溶液濃度的設定通過初篩預實驗根據鮮切紫甘薯的貨架期篩選得出，分別為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 g/L五種濃度。實驗以蒸餾水處理組作為對照。

1.3.2 失重率的測定

稱重法，對保存的鮮切紫甘薯片進行稱重。

(1)

式中：W0，貯藏第0天鮮切紫甘薯片的重量，g；Wn，貯藏第n天鮮切紫甘薯片的重量，g。

1.3.3 色差的測定

(2)

式中：ΔEn,貯藏第n天鮮切紫甘薯片的色差；ΔE0，貯藏第0天鮮切紫甘薯片的色差。

1.3.4 硬度的測定

硬度用水果硬度計測定，取3片鮮切紫甘薯片，手握硬度計，探頭豎直按壓切片，直至切片沒過探頭節點處，結果取平均值。由于鮮切紫甘薯之間的個體差異，采用硬度變化率來表示鮮切紫甘薯貯藏期間硬度的變化。

(3)

式中：硬度0，貯藏第0天鮮切紫甘薯片的硬度；硬度n，貯藏第n天鮮切紫甘薯片的硬度。

1.3.5 褐變度變化量的測定

采用消光值法[17]，略作修改。取2.0 g紫甘薯樣品，加入10 mL 80%乙醇溶液，研磨成勻漿，室溫避光放置30 min，每5 min攪拌1次。4℃ 8 000 r/min離心10 min，取上清液在420 nm測定吸光度值，以80%乙醇作為空白，測3次取平均值，結果表示為褐變度BD=A×V/m，A420為測定的吸光度值，V為提取液體積，m為樣品質量。

褐變度變化量ΔBD=BD12-BD0

(4)

式中：BD0，第0天時的褐變度；BD12，第12天時的褐變度。

(5)

式中：ΔBDCK，對照第12天的褐變度-對照第0天的褐變度；ΔBD樣，樣品第12天的褐變度-樣品第0天的褐變度。

1.3.6 過氧化物酶活力的測定

采用愈創木酚法測定[18]，略作修改。粗酶液的制備：取2.0 g紫薯樣品，加入預冷的10 mL提取緩沖液(340 mg PEG 6000、4 g PVPP、1 mL Triton X-100，用0.1mol/L pH 5.5乙酸-乙酸鈉緩沖液溶解定容至100 mL)，在冰浴條件下研磨成勻漿，濾液于4℃ 12 000 r/min離心30 min，取上清液為酶提取液。

反應體系中含3 mL 25 mmol/L愈創木酚0.5 mL酶液，加入200 μL 0.5 mol/L H2O2迅速混勻啟動反應，立即開始計時，每隔20 s記錄反應體系在470 nm波長下的吸光值變化，以每分鐘吸光度值變化增加1時所需的酶量為1個活性單位，單位為U/mg prot。

1.3.7 多酚氧化酶活力的測定

采用鄰苯二酚法測定，略作修改。粗酶液的制備：稱取1.0 g鮮切紫甘薯樣品，加入10.0 mL的提取緩沖液(0.05 mol/L pH 6.8 磷酸緩沖液)，研磨成勻漿，于4℃、12 000 r/min離心30 min，收集上清液，為酶提取液。

酶促反應體系由4.0 mL、50 mmol/L、pH 5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液、1.0 mL、50 mmol/L鄰苯二酚溶液和 100 μL酶提取液，立即開始計時。以蒸餾水為空白參比，在反應15 s時開始記錄反應體系在420 nm處吸光度值，作為初始值，每隔20 s記錄1次，連續測定，至少記錄6個點。重復3次。以每分鐘吸光度值變化增加1時所需的酶量為1個活性單位，單位是U/ mg prot。

1.3.8 MDA含量的測定

取2.0 g新鮮紫甘薯樣品，按m∶V=1∶20的比例加入100 g/L TCA溶液，研磨成勻漿，于4℃ 10 000 r/min離心20 min，收集上清液。取2 mL上清液加入2 mL 0.67%TBA，沸水中煮沸20 min，取出后冷卻離心。分別測定在450、532和600 nm的吸光度，以100 g/L TCA溶液作為空白管。

1.3.9 花色苷含量測定

花色苷含量測定采用pH示差法[19]。花色苷提取液：取2.00 g紫薯樣品，按m∶V=1∶20的比例加入提取液(V(乙醇)∶V(水)∶V(HCl)=2∶1∶0.1)，勻漿，避光60℃浸提60 min，在4℃、3 000 r/min離心15 min。

取2 mL提取液分別用pH 1.0 鹽酸-氯化鉀緩沖溶液和pH 4.5鹽酸-醋酸鈉緩沖溶液稀釋定容至10 mL，靜置90 min。用蒸餾水做對照，分別測定其在530 nm和700 nm處的吸光度值。

ΔA=(A1(530)-A1(700))-(A2(530)-A2(700))

(6)

式中：A1(530)和A1(700)分別為用pH1.0鹽酸-氯化鉀緩沖溶液稀釋定容后在530 nm和700 nm測得的吸光度值；A2(530)和A2(700)分別為用pH4.5鹽酸-醋酸鈉緩沖溶液稀釋定容后在530 nm和70 nm測得的吸光度值。

(7)

式中：ε，矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數，26 900 L/(mol·cm)；M，矢車菊-3-葡萄糖苷的相對分子質量，449.2 g/mol；V，定容的體積，mL；F，稀釋倍數；m為樣品質量，g；L為比色皿的寬度，1 cm。

1.3.10 總酚含量

總酚測定采用福林-酚比色法[19]。總酚提取液：取2.00 g紫薯樣品，按m∶V=1∶20的比例加入提取液(V(乙醇)∶V(水)∶V(HCl)=2∶1∶0.1)，勻漿，避光60 ℃浸提60 min，在4℃、3 000 r/min離心15 min。

標準曲線制作：將1 mg/mL沒食子酸母液稀釋成0.1 mg/mL的沒食子酸標準溶液，分別吸取該溶液0.0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于25 mL的比色管中，加蒸餾水定容至1 mL搖勻后加入0.5 mL福林酚試劑(2 mol/L)，暗處放置5 min后加入2 mL、200 g/L的Na2CO3溶液，加蒸餾水補足至25 mL，搖勻，室溫避光反應1 h，于760 nm處測定吸光度。沒食子酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，求得線性方程。

樣品中總酚含量測定：取一定量提取液于比色管中，其余測定方法同標準曲線制作，用沒食子酸作標準曲線計算含量，單位為mg/100g。

2 結果與分析

2.1L-cys質量濃度對鮮切紫甘薯失重率的影響

失重率是衡量鮮切后甘薯呼吸底物消耗量和水分蒸發量的重要指標。由圖1可知，各實驗組失重率均隨著貯藏時間的呈現上升趨勢，且均低于對照組，說明L-cys能夠很好地起到控制鮮切紫甘薯重量的作用。其原因可能是經過L-cys處理后，更好地保持了產品新鮮度，從而減少了水分的散失。相比之下，濃度為2 g/L時處理的鮮切紫甘薯的失重率在整個貯藏期都處于較低水平，貯藏到第12天時為0.13%。在整個貯藏期間，2 g/LL-cys組失重率與對照組之間始終存在顯著性差異(P<0.05)。

圖1 不同質量濃度L-cys對鮮切紫甘薯失重率的影響Fig.1 Effect of different concentrations of L-cysteineon the weight loss rate注：小寫字母不同表示對照組與L-半胱氨酸處理組樣品差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2L-cys質量濃度對鮮切紫甘薯硬度下降率的影響

由圖2可知，隨著貯藏時間的延長，各實驗組硬度均逐漸降低，且處理組硬度下降率明顯低于對照組。其原因可能是L-cys可以較好地保持鮮切紫甘薯的新鮮程度，防止水分的蒸發流失，維持鮮切紫甘薯的細胞膨壓，從而較好地保持鮮切紫甘薯的硬度。處理濃度為0.5 g/L時的硬度下降率趨勢與對照組一致，前期上升速度較快，而后平緩；其他的實驗組的硬度下降率在貯藏期間都保持在一個緩慢上升的狀態，其中處理濃度為2.0 g/L的實驗組在貯藏過程一直比較穩定。在整個貯藏期間，2.0 g/LL-cys組硬度變化率與對照組之間始終存在顯著性差異(P<0.05)。

圖2 不同質量濃度L-cys對鮮切紫甘薯硬度變化率的影響Fig.2 Effect of different concentrations of L-cysteineon the hardness change rate

2.3L-cys質量濃度對鮮切紫甘薯色澤的影響

由圖3可知，貯藏過程中，鮮切紫甘薯的色差變化率呈上升趨勢，用蒸餾水處理的對照組明顯高于L-cys處理組，說明L-cys有很好地保持鮮切紫甘薯色澤的作用，其原因可能是由于L-cys較好地保持了鮮切紫甘薯的新鮮度，延緩了衰老，影響了營養物質花色苷的流失以及抑制了褐變，通過這兩方面使鮮切紫甘薯保持了較好的色澤，顏色更加鮮亮。2.0 g/L的處理組色差變化率最低，第12天時僅為1.39%。L-cys的濃度越高并沒有使鮮切紫甘薯的色差變化率降低，反而有上升的趨勢，說明過高濃度的L-cys會使鮮切紫甘薯表面發生變化，從而影響其護色效果。在整個貯藏期間，2.0 g/LL-cys組色差變化率與對照組之間始終存在顯著性差異(P<0.05)。

圖3 不同質量濃度L-cys對鮮切紫甘薯色差變化率的影響Fig.3 Effect of different concentrations of L-cysteineon the color difference change rate

2.4L-cys質量濃度對鮮切紫甘薯褐變的影響

褐變是影響果蔬品質的重要因素，褐變不僅對它們的外觀有負面影響，還可能損害其他感官特性，包括味覺、氣味和結構，以及營養價值[20-21]。褐變度變化量越高，表明褐變越嚴重。鮮切紫甘薯褐變度隨貯藏時間的延長持續上升。由圖4可以看出，L-cys處理組鮮切紫甘薯褐變度變化量都顯著低于對照組，說明L-cys可以抑制鮮切紫甘薯的褐變。L-cys可能通過與褐變底物酚反應生成無色化合物來抑制褐變，以及抑制多酚氧化酶的活性或通過自身帶有還原性的疏基基團等多方面來控制褐變。隨著L-cys濃度的上升，鮮切紫甘薯褐變度變化量呈現先下降后上升的趨勢，過高濃度的L-cys并不能較好地抑制鮮切紫甘薯的褐變。當L-cys的處理濃度為2.0 g/L時，褐變度變化量最低，即護色效果最好，褐變度抑制率可達 62.5%。

圖4 不同濃度L-cys對鮮切紫甘薯褐變度變化量的影響Fig.4 Effect of different concentrations of L-cysteineon browning注：**表示與空白組相比差異顯著(P<0.01)。

以上結果表明，L-cys處理濃度為2.0 g/L時，可較好地維持鮮切紫甘薯的質量、硬度及色澤，以及延緩紫甘薯褐變的作用。

2.5L-cys對鮮切紫甘薯POD活性的影響

過氧化物酶(peroxidase，POD)與衰老相關，其活性能間接說明細胞內的過氧化作用的高低。當有H2O2存在時，POD可氧化類黃酮、酚類物質，使其聚合成褐色物質，影響鮮切產品的感官[22]。由圖5可知，在整個儲藏期間，鮮切紫甘薯的POD活性呈現先上升后下降的趨勢，這與程雙等的研究結果一致[23]，鮮切紫甘薯經L-cys處理后POD活性得到顯著抑制，隨貯藏時間的延長，處理組POD活性持續低于對照組。在第6天時達到峰值。儲藏前期POD活性的上升可能是由于機械損傷導致的，同時可能還會產生POD同工酶；后期的下降可能是由于傷害產生的損傷作用減小導致[24]。L-cys處理組的POD活性始終顯著低于對照組(P<0.05)，相比較于對照組，第6天時，2.0 g/LL-cys處理組對POD的抑制率可以達到53.50%。2.0g/LL-cys能夠有效抑制POD的活性。

圖5 L-cys對鮮切紫甘薯POD活性的影響Fig.5 Effect of L-cysteine on POD of fresh-cutpurple sweet potato

2.6L-cys對鮮切紫甘薯PPO活性的影響

多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO) 是植物體內普遍存在的一種末端氧化還原酶[25-26]。其是使鮮切產品發生酶促褐變的主要酶類，多以潛伏的狀態存在，當果蔬組織受到破壞后，PPO被激活，使酚類物質被氧化為醌，醌類物質聚合導致鮮切產品的褐變[27]。PPO是鮮切紫甘薯發生酶促褐變的主要酶類之一。由圖6可知，在整個貯藏期間，多酚氧化酶活性一直呈現上升趨勢。對照組PPO活性持續上升明顯，L-cys處理組可將鮮切紫甘薯PPO活力保持在一個較低水平，緩慢上升,第12天時，L-cys處理組PPO活性對比初始只有輕微上升，與對照組差別較大。可能是由于L-cys可與醌類物質的直接結合，消除醌類物質之間或醌類物質與底物之間的反應，從而起到抑制PPO活性的作用[28]。2.0 g/LL-cys能夠有效地抑制PPO的活性，與對照組之間始終存在顯著性差異(P<0.05)。

圖6 L-cys對鮮切紫甘薯PPO活性的影響Fig.6 Effect of L-cysteine on PPO of fresh-cutpurple sweet potato

2.7L-cys對鮮切紫甘薯MDA含量的影響

丙二醛(malondialdehyde，MDA)是膜脂過氧化的產物之一，其含量的高低可以表示果蔬膜系統的損害情況[29-30]，是評價鮮切產品腐爛情況的重要指標。由于切割導致細胞膜的脂過氧化程度會隨著貯藏時間的延長而積累[31]，所以鮮切紫甘薯的MDA含量隨著貯藏時間的增長而增加。由圖7可知，鮮切紫甘薯的MDA含量不斷上升，2.0 g/LL-cys處理組的MDA含量在貯藏過程中維持在較低水平，且顯著低于對照組(P<0.05)，這說明L-cys能夠有效抑制鮮切紫甘薯MDA含量的生成，從而延緩鮮切紫甘薯的衰老，使鮮切紫甘薯保持新鮮，延緩了褐變，較好地維持了鮮切紫甘薯的色澤。

圖7 L-cys對鮮切紫甘薯MDA含量的影響Fig.7 Effect of L-cysteine on MDA content of fresh-cutpurple sweet potato

2.8L-cys對鮮切紫甘薯花色苷含量的影響

花色苷是一種天然紫色素,穩定性較好,安全無毒副作用[32]，是紫甘薯的主要營養成分，可以抑制致癌物質,還具有抑制肥胖,增強人體免疫力,增強體質,延緩衰老,提升視力等多種作用[33-35]。在整個貯藏期間，花色苷含量呈下降趨勢。第12天時，2.0 g/LL-cys處理組的花色苷含量((144.70±2.31) mg/100 g)顯著高于對照組((110.93±1.02) mg/100 g)，說明L-cys可較好地保持鮮切紫甘薯的花色苷含量。

2.9L-cys對鮮切紫甘薯總酚含量的影響

在加工貯藏階段，酚類物質作為褐變底物的存在，是造成果蔬褐變的重要原因，在酚酶作用下極易發生氧化，造成產品色澤的下降其含量直接影響鮮切產品的褐變進程。實驗測得鮮切紫甘薯的總酚含量呈現先上升后下降的趨勢，這與潘艷芳等[36]的研究結果相一致。對照組總酚含量持續高于處理組，在第6天時達到峰值，為褐變提供了豐富的底物，從而促進褐變。對第6天時L-cys處理組與對照組的總酚含量進行了比較。貯藏到第6天時，0.2 g/LL-cys處理組的總酚含量為(108.04±1.17)mg/100 g，顯著低于對照組的(126.62±0.39)mg/100 g，可以說明L-cys能較好地抑制鮮切紫甘薯總酚含量的增加。

3 結論與討論

褐變主要分為酶促褐變和非酶促褐變，而果蔬的褐變主要是酶促褐變。褐變通常會損害產品的感官特性，一旦細胞壁和細胞膜失去其完整性，酶促氧化進行得更快。植物組織細胞中,酚類物質和酶類通過膜系統區域化分布不直接接觸，多酚類物質存在于液泡內，而PPO多分布在細胞質內，所以即使有O2存在的條件下也不會發生酶促褐變。但由于切分等脅迫條件導致細胞膜系統的完整性遭到破壞，底物酚類物質與PPO接觸，當有O2參與時，酚類物質會被氧化成醌類物質，進行一系列的反應，最后聚合形成黑、褐色物質，從而引起果蔬的褐變[37]。本研究表明L-cys可以抑制鮮切紫甘薯POD、PPO活性，減少MDA以及總酚含量的積累，從而顯著延緩鮮切紫甘薯的褐變，使其保有較好的色澤品質和營養價值，達到護色保鮮作用，延長貨架期。通過比較得到L-cys溶液的最佳處理濃度為2.0 g/L，使用這種護色方法，能使鮮切紫甘薯褐變度抑制率達到62.5%。貯藏到第12天時，失重率、色差增長率分別為0.13%、1.39%，POD抑制率可達到53.50%，鮮切紫甘薯的花色苷含量得到了很好的保持。