超聲輔助萃取辣木莖生物堿工藝及抑制α-葡萄糖苷酶作用研究

姜翠翠，李穎，邱松山，周英彪

(廣東石油化工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院,果蔬加工與貯藏工程技術(shù)開發(fā)中心，廣東 茂名,525000)

辣木(Moringaoleifera)屬辣木科辣木屬植物，營養(yǎng)比較全面，其根、莖、葉、花、種子、枝條等均含有較為豐富的蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)元素、脂肪、氨基酸等營養(yǎng)成分，具有較高的藥用價值[1-2]，辣木籽油中的油酸等物質(zhì)也具有較強(qiáng)的抗炎、調(diào)節(jié)血脂作用[3-4]。SREELATHA等利用辣木提取物對抗和誘導(dǎo)人類癌癥細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明辣木提取物具有很強(qiáng)的抗癌和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，可被作為潛在的癌癥治療藥物[5]。生物堿是存在于自然界的一類含氮天然化合物，研究表明生物堿是中草藥中重要的有生物活性的成分之一[6-7]。辣木富含多種生物，包括多酚類、皂苷類、生物堿類等，其中生物堿類物質(zhì)具有抗炎、抑菌等活性[8-10]。目前對辣木的提取工藝主要有微波萃取、有機(jī)溶劑萃取、超聲波萃取、超臨界流體萃取等[11-12]，傳統(tǒng)的溶劑提取技術(shù)耗時長、效率低，且易引起生物活性下降，超聲波萃取技術(shù)因其快速、高效得到廣泛應(yīng)用，目前關(guān)于辣木的研究主要在辣木葉深加工[13]、多酚[14]、多糖[15-16]應(yīng)用等方面，超聲技術(shù)應(yīng)用于提取辣木中生物堿類物質(zhì)的研究較少，因此本研究主要以辣木莖為原料，采用超聲波輔助提取其生物堿類物質(zhì)，運(yùn)用Central Composite Design響應(yīng)面設(shè)計進(jìn)行工藝優(yōu)化，并研究了辣木生物堿對α-抑制葡萄糖苷酶抑制作用，為進(jìn)一步促進(jìn)其醫(yī)藥用途的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮辣木由廣東信宜三保惠民信息服務(wù)專業(yè)合作社提供，帶葉采摘后3～4 h運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室，分揀去葉后的辣木莖經(jīng)50 ℃干燥、粉碎過40目篩備用。

α-葡萄糖苷酶(E.C.3.2.1.20),酶活性為50 000 U/mL,上海金穗生物科技有限公司；4-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside,PNPG),北京夢怡美生物科技有限公司；阿卡波糖(acarbose，50 mg/片),德國拜耳醫(yī)藥公司；無水乙醇、Na2CO3、KH2PO4等試劑均為國產(chǎn)分析純，所用水為超純水。

XFB-200高速中藥粉碎機(jī)，吉首市中誠制藥機(jī)械廠；BILON-2006低溫超聲波萃取儀，上海比朗儀器有限制造有限公司；UV-5100紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；GB204 型電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司。

1.2 生物堿的測定

1.2.1 溴甲酚綠溶液

準(zhǔn)確稱取溴甲酚綠50.00 mg，加入100 mL燒杯中，加入6.0 mL 0.2 mol/L NaOH溶液溶解，再準(zhǔn)確稱取鄰苯二甲酸氫鉀1.020 g，加入適量蒸餾水溶解后定容調(diào)節(jié)pH值至4.4，備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

貝母素甲對照品溶液：準(zhǔn)確稱取貝母素甲20 mg，放置于50 mL容量瓶中，加入少量無水乙醇使其溶解后定容，搖勻，備用。參考文獻(xiàn)[17]的方法精密量取貝母素甲對照品溶液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL于10 mL容量瓶中，各加1.2.1中的溴甲酚綠溶液1.0 mL，搖勻后再加入三氯甲烷溶液10.0 mL，混勻、靜置、過濾，以三氯甲烷液為空白對照，在411 nm處測定對照品及空白溶液吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，計算所得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：A=0.037 61C-0.011 48，R2=0.999 2(其中A為吸光度，C為質(zhì)量濃度mg/L)，結(jié)果表明在10～150.0 mg/L線性關(guān)系良好。

1.3 單因素試驗(yàn)

以辣木莖生物堿的含量為指標(biāo)，考察超聲萃取時間、功率、料液比以及乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取率的影響分別進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取烘干至質(zhì)量恒定的辣木莖粉末10 00 g，采用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇進(jìn)行萃取，在不同的超聲波功率、料液比下超聲輔助萃取一定時間，抽濾，濾液濃縮備用，將提取得到的生物堿溶于10 mL無水乙醇，于25 mL容量瓶中搖勻定容，備用。按照1.2.2的方法測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算生物堿的提取率。

1.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇超聲萃取時間、功率、料液比以及乙醇體積分?jǐn)?shù)為考察因素，提取率為響應(yīng)值，采用Central Composite Design進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計，實(shí)驗(yàn)水平和編碼見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)的因子水平和編碼Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.5 抑制α-葡萄糖苷酶活性測定

參照王占一等[18]的試驗(yàn)方法，有改動。準(zhǔn)確移取1.5 mL 0.1 mol/L的磷酸(PBS)緩沖液(pH 6.8)及0.25 mL 0.2 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液于試管中，加入不同濃度的樣品溶液0.25 mL，混勻后于37 ℃恒溫反應(yīng)15 min，加入0.25 mL 2.5 mmol/L的PNPG溶液于37 ℃恒溫反應(yīng)20 min后，再加入0.2 mol/L的Na2CO3溶液1 mL終止反應(yīng)，并于405 nm波長下測定吸光度值，記作樣品組A1。以PBS緩沖液代替酶，其他條件同樣品組A1，記作樣品空白組A2。以PBS緩沖液代替樣品溶液，其他條件同樣品組，記作陰性對照組A3。以PBS緩沖液代替酶液和樣品溶液，其他條件同樣品組，記作空白組A4。以阿卡波糖為陽性對照，平行測定5次，取其平均值(樣品濃度和阿卡波糖濃度梯度均為20、40、60、80、100、120 μg/mL)。α-葡萄糖苷酶活力單位定義為：pH 6.8 37 ℃條件下每分鐘釋放1.0 mol硝基酚為1個活力單位，實(shí)驗(yàn)設(shè)計如表2所示。

表2 抑制α-葡萄糖苷酶活性實(shí)驗(yàn)設(shè)計Table 2 Design of inhibition activity α-glucosidase of alkaloid

注：“-”表示無。

按公式(1)計算樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制率及IC50：

(1)

1.6 對α-葡萄糖苷酶抑制作用的動力學(xué)試驗(yàn)

設(shè)置5個不同濃度PNPG(1.0、1.5、2.0、2.5、5.0 mmol/L)，3個不同樣品質(zhì)量濃度(0、50、100 g/L)、0.2 U/mL α-葡萄糖苷酶濃度，參照1.5的方法，以反應(yīng)速度的倒數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制Lineweaver-Burk曲線，判斷樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制類型。設(shè)置6個不同的α-葡萄糖苷酶濃度(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 U/mL)，固定底物PNPG的濃度(2.5 mmoL/L)不變，以酶濃度為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速率為縱坐標(biāo)，研究樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制作用是否可逆。

1.7 統(tǒng)計分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel和Design Expert 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用單因素方差(One-way ANOVA) 分析方法進(jìn)行多重比較，P<0.05和P<0.01分別表示差異顯著和極顯著，試驗(yàn)重復(fù)測試3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

超聲輔助萃取辣木莖生物堿工藝中超聲功率、乙醇濃度、超聲時間、料液比對提取率的影響如圖1所示。

a-超聲功率對提取率的影響;b-乙醇濃度對提取率的影響;c-超聲時間對提取率的影響;d-料液比對提取率的影響圖1 辣木生物堿萃取工藝中超聲功率、乙醇濃度、超聲時間和料液比對提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power, ethanol concentration, extraction time, solid-liquid ratio on the extraction yieldof alkaloids from Moringa oleifera

由圖1-a可知，在其他萃取條件一定的情況下，超聲功率為250 W時，生物堿提取率達(dá)到21.47 mg/g，當(dāng)功率大于250 W時，其提取率呈下降趨勢，這可能是由于隨超聲功率增大，分子運(yùn)動導(dǎo)致生物堿分子氧化、分解引起的。由圖1-b可知，在其他萃取條件不變的情況下，生物堿提取率隨萃取溶劑乙醇濃度的增大而升高，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時，生物堿提取率達(dá)到26.24 mg/g。由圖1-c可知，在其他條件不變的情況下，生物堿提取率隨超聲提取時間的延長而增加，30 min時提取率先增加到19.14 mg/g，而后下降，這可能是由于在30 min時生物堿大部分已溶出，故確定提取過程的適宜的超聲時間為30 min。由圖1-d可知，在其他萃取條件不變的情況下，辣木中的生物堿提取率隨料液比的增加先上升后下降，當(dāng)料液比為1∶10時提取率為24.80 mg/g。當(dāng)料液比大于1∶10時，其提取率的變化呈下降趨勢，可能是由于低濃度的液料比使生物堿提取不充分，高濃度的液料比會導(dǎo)致一些其他物質(zhì)溶出引起的。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)分析

根據(jù)Central Composite Design響應(yīng)面設(shè)計的原理，以超聲波功率(A)、時間(B)和料液比(C)為響應(yīng)面的影響因數(shù)，生物堿提取率為響應(yīng)值，基于單因素實(shí)驗(yàn)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面分析及結(jié)果Table 3 Response surface design analysis and experimental results

根據(jù)表3的數(shù)據(jù)來計算各項(xiàng)回歸系數(shù)，用回歸系數(shù)建立相關(guān)因子的數(shù)學(xué)回歸模型，得到超聲輔助萃取生物堿的響應(yīng)面模型為：

Y=32.54-0.076A-0.12B-2.34C-1.76A2-2.28B2-4.81C2+0.19AB+0.12AC+0.36BC

對該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表4所示。

表4 回歸模型方差分析表Table 4 Analysis of variance of the equation

注：**表示極顯著，P<0.001，*表示顯著，P<0.05。

2.3 交互作用分析

從回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)可知，超聲時間、功率與料液比的互作效應(yīng)對生物堿提取率影響明顯，根據(jù)二次回歸方程繪制的響應(yīng)面如圖2所示。

由圖2-a可知，當(dāng)超聲功率一定時，隨著時間的增加，生物堿提取率增大，超聲時間29.54 min時提取率最大，超聲波功率的影響也是先增大后減小，在時間的交互作用下最佳的超聲波功率為248.40 W。超聲功率和時間交互作用較為顯著，與模型的方差分析結(jié)果一致。由圖2-b可知，當(dāng)超聲波功率一定時，隨著料液比的增大提取率增大，料液比為1∶8.78時，生物堿提取率到達(dá)最大值。此外，料液比的曲面變化要比超聲波功率的陡峭，等高線變化密集程度高于超聲波功率等高線變化密集程度，表明料液比對生物堿提取率影響較大。由圖2-c可知，超聲功率不變，隨著料液比的增大生物堿提取率增大，料液比到達(dá)1∶8.78時，生物堿提取率最大，但當(dāng)料液比超過1∶8.78之后，生物堿提取率開始下降。在料液比的交互作用下，最佳時間為29.54 min。此外，料液比的曲面變化要比時間的陡峭，等高線變化密集程度高于時間等高線變化密集程度，表明料液比對生物堿提取率影響較為顯著，這與模型的方差分析結(jié)果一致。超聲波輔助提取辣木莖生物堿的最優(yōu)工藝條件為是：超聲波功率248.40 W、超聲波時間29.54 min、料液比1∶8.78 (g∶mL)，生物堿的模型預(yù)測值為32.83 mg/g，為進(jìn)一步檢驗(yàn)響應(yīng)面分析法的可靠性，經(jīng)優(yōu)化后的生物堿提取工藝參數(shù)為超聲波功率250 W、萃取時間30 min、料液比1∶9 (g ∶mL)，最終測得平均提取率為32.78 mg/g，與預(yù)測值誤差為0.15%，因此采用響應(yīng)面分析優(yōu)化得到的浸提參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

a-超聲時間和超聲功率的交互作用;b-超聲功率和料液比的交互作用;c-超聲時間和料液比圖2 辣木莖生物堿的超聲提取響應(yīng)曲面圖Fig.2 Response surface plots showing the pairwise effects of supersonic time, supersonic wave power and ratio of solid-liquid on the extraction rate of pectin

2.4 辣木生物堿對α-葡萄糖酶活性的抑制作用

辣木莖生物堿對α-葡萄糖酶活性的抑制作用影響結(jié)果如圖3所示。

如圖3所示，在20～120 mg/L隨辣木莖中的生物堿濃度的增加，其對α-葡萄糖苷酶的抑制作用逐漸增加，120 mg/L的生物堿對α-葡萄糖苷酶抑制率達(dá)到86.11%，IC50可表示生物堿對α-葡萄糖苷酶抑制的強(qiáng)弱，IC50值越小說明其抑制效果越好。經(jīng)計算生物堿與阿卡波糖的IC50分別為0.034 g/L和0.022 g/L(P<0.05)，表明生物堿對α-葡萄糖苷酶活性具有較強(qiáng)的抑制作用，這與文獻(xiàn)[19-20]報道的研究結(jié)果比較一致。

圖3 辣木莖生物堿對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用比較Fig.3 Comparison of inhibition activity of α-glucosidase of alkaloids from Moringa oleifera

2.5 生物堿對α-葡萄糖苷酶抑制作用的動力學(xué)試驗(yàn)

根據(jù)Lineweaver-Buck曲線及反應(yīng)速率曲線判斷生物堿的酶促反應(yīng)中抑制劑的抑制類型的結(jié)果如圖4所示。

a-Lineweaver-Burk曲線;b-反應(yīng)速率曲線圖4 生物堿對α-葡萄糖苷酶抑制作用的曲線Fig.4 The curve of Lineweaver-Burk and reaction rate of inhibition α-glucosidase of alkaloids from Moringa oleifera

由圖4-a可知，生物堿對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的Lineweaver-Burk曲線中無抑制劑組的線性回歸方程為：y=8.643x+4.662；50 g/L抑制劑組的線性回歸方程為：y=12.882x+4.665；100 g/L抑制劑組的線性回歸方程為：y=17.299x+4.684，R2均大于0.998 0，隨著抑制劑的濃度增大反應(yīng)速率增強(qiáng)；當(dāng)?shù)孜餄舛认嗤瑫r，抑制劑濃度從0增加到100 g/L，反應(yīng)速率降低，由此可知生物堿對α-葡萄糖苷酶的抑制作用為競爭性抑制。由圖4-b可知，所得的酶濃度-反應(yīng)初速率曲線具有相同的變化趨勢，當(dāng)酶濃度相同時抑制劑濃度從0增加到100 g/L，直線斜率從0.84下降到0.52，表明生物堿對α-葡萄糖苷酶具有可逆抑制作用。

3 結(jié)論

本文結(jié)合單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)考察了超聲功率、提取時間和料液比對辣木莖生物堿提取效果的影響。結(jié)果表明，超聲輔助萃取辣木莖中的生物堿類物質(zhì)的最佳工藝參數(shù)為超聲功率250 W、超聲波時間30 min、料液比1∶9 (g∶mL)，生物堿的提取率為32.78 mg/g。

辣木莖生物堿對α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究表明，當(dāng)生物堿質(zhì)量濃度為120 mg/L時，對α-葡萄糖苷酶抑制率達(dá)到86.11%，抑制作用的IC50為0.034 g/L。通過分析Lineweaver-Burk曲線和酶濃度-反應(yīng)初速率曲線可知，在質(zhì)量濃度20～120 mg/L，生物堿濃度與其對α-葡萄糖苷酶抑制效果之間呈現(xiàn)一定的正相關(guān)關(guān)系，其抑制機(jī)理屬于競爭性抑制和可逆性抑制。