百合酵素自然發酵過程中有機酸及其體外抗氧化活性的變化

方晟，陳犇，沙如意，毛建衛,3*

1(紹興文理學院 元培學院，浙江 紹興,312000) 2(浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室，浙江科技學院 生物與化學工程學院，浙江 杭州,310023) 3(浙江工業職業技術學院，浙江 紹興,312000)

食用植物酵素(edible plant Jiaosu)是以新鮮蔬菜、水果、藥食兩用本草類為原料，經多種有益菌通過較長時間發酵而生產的功能性發酵產品，可有效清除體內過剩的活性氧自由基，在預防和治療因自由基誘發的疾病和抗衰老方面具有廣闊的應用前景[1-2]。食用植物酵素既保持了植物自身營養成分、也含有乳酸菌等有益微生物及其代謝產生的功能性小分子物質等，其中有機酸是一項重要指標，對酵素產品的特有風味及抗氧化等功能性作用有重要影響[3-4]。目前酵素品類繁多，但品質差別大，且相關科學研究支撐不足，亟需深入開展酵素發酵過程功能組分和功效研究，進而用標準化手段規范傳統工藝，保證酵素品質。

百合為百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)植物，是國家衛計委公布的首批“藥食同源”植物之一，其食用、藥用部位均為卷丹(LiliumlancifoliumThunb.)、百合(L.browniiF.E.Brown var.viridulumBaker)和細葉百合(L.pumilumDC.)的肉質鱗葉，藥理實驗表明，其具有抗腫瘤、降血糖、抗氧化、消炎等作用[5-6]。目前百合在功能性食品和藥品領域的深入開發較少，主要用于鮮食或加工成百合干、百合淀粉、百合飲料等，附加值相對較低[7]。從食用安全性和保健功效考慮，百合是開發食用酵素的優良植物資源，但目前未見關于百合酵素的研究報道。本研究以百合為主要原料制備食用植物酵素，探討對其自然發酵過程中體外抗氧化活性、有機酸組成及含量的變化規律，以期為百合酵素產品的開發及精準制備提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮百合，蘭州米家山百合有限責任公司；發酵糖液，浙江省農產品化學與生物加工技術重點實驗室。

α,α-二苯基-β-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)、吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate，PMS)、硝基四氮咪唑藍(nitrotetrazolium blue chloride，NBT)、2,2-聯氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽(2,2′-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS)、有機酸標準品，美國Sigma公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、K2HPO4、H3PO4、甲醇、鐵氰化鉀、三氯乙酸、FeCl3、水楊酸鈉、FeSO4、HCl，均為分析純，上海展云化工有限公司。

1.2 儀器與設備

LC-20A高效液相色譜儀，日本島津公司；TU-1810紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司； PHS-3C酸度計，上海佑科儀器儀表有限公司；Allegra X-12R型冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司；SW-CJ-1B超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 百合酵素的制備

用去離子水清洗百合表面去除雜質，自然晾干。百合和發酵糖液按質量比3∶5混勻后，加入到已滅菌的玻璃瓶中密封，室溫下避光發酵。發酵過程中，分別在第5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90天取樣，樣品于10 000 r/min離心10 min后，保留上清液待測。

1.3.2 超氧自由基清除能力的測定

采用PMS/NADH體系還原NBT法[8]，50 μL樣品加入到950 μL磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.4)，然后加入1 mL 120 μmol/L的PMS(用0.1 mol/L的PBS配制，pH 7.4)，1 mL 936 μmol/L的NADH(用0.1 mol/L的PBS配制，pH 7.4)和1 mL 300 μmol/L的NBT(用0.1 mol/L的PBS，pH 7.4配制)。在環境溫度下反應5 min。以去離子水為參比溶液。在560 nm處測定吸光度，如公式(1)所示：

(1)

式中：A0為空白對照液吸光度；A1為樣品測定管吸光度；A2為樣品本底管吸光度。

1.3.3 羥自由基清除能力的測定

采用Fenton法[9]，335 μL樣品加入到1.4 mL 6 mmol/L的H2O2，加入0.6 mL 20 mmol/L的水楊酸鈉和2 mL 1.5 mmol/L的FeSO4，37 ℃下恒溫水浴1 h。以去離子水為參比溶液，在562 nm下測定吸光度，如公式(2)所示：

(2)

式中：A0為空白對照液吸光度；A1為樣品測定管吸光度；A2為樣品本底管吸光度。

1.3.4 DPPH自由基清除能力的測定

采用DPPH甲醇溶液顯色法[10]，40 μL樣品加入到4 mL 0.1 mmol/L的DPPH-甲醇溶液中，再加入450 μL,50 mmol/L的Tris-HCl 緩沖液(pH 7.4)，25℃下恒溫水浴30 min。以去離子水為參比溶液。在517 nm處測定吸光度，如公式(3)所示：

(3)

式中：A0為空白對照液吸光度；A1為樣品測定管吸光度；A2為樣品本底管吸光度。

1.3.5 ABTS自由基清除能力的測定

采用ABTS過硫酸鉀顯色法[11]，用7 mmol/L的ABTS(用5 mmol/L的PBS配制，pH 7.4)，加入過硫酸鉀，最終濃度為2.45 mmol/L，在室溫下黑暗放置12～16 h。使用前把ABTS自由基用PBS稀釋成在734 nm下吸光度為(0.7±0.02)。取10 μL樣品加入到5 mL上述稀釋液中，在30 ℃下反應5 min。以去離子水為參比溶液。在734 nm處測定吸光度，如公式(4)所示：

(4)

式中：A0為空白對照液吸光度；A1為樣品測定管吸光度；A2為樣品本底管吸光度。

1.3.6 還原力的測定

采用鐵氰化鉀法[12]，30 μL樣品加入到2.5 mL H3PO4緩沖液(0.2 mol/L，pH 6.6)，然后加入2.5 mL 10 g/L鐵氰化鉀，50 ℃反應30 min，再加入100 g/L三氯乙酸2.5 mL，在3 000 r/min下離心10 min，立即取2.5 mL上清液，加入2.5 mL去離子水和0.5 mL 1 g/L FeCl3。以去離子水為參比溶液。在700 nm處測定吸光度。

1.3.7 有機酸含量的測定

有機酸含量的測定采用高效液相色譜法，參考SCHERER等[13]的方法進行。HPLC分離條件：色譜柱為Agilent TC-C18柱(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm)，流動相為0.01 mol/L的KH2PO4溶液(用磷酸調pH=2.7)，流速1 mL/min，柱溫20 ℃，檢測波長210 nm。待測樣品用0.01 mol/L的KH2PO4溶液(pH 2.7)稀釋5倍，0.22 μm微孔濾膜過濾后直接進樣。

1.4 數據處理與分析

全部試驗均平行進行3次，試驗結果表示為均值±標準差(Mean±SD)形式。采用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析、聚類分析及相關性分析，采用Origin 8.6軟件繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 百合酵素發酵過程中體外抗氧化活性的變化

2.1.1 發酵過程中超氧自由基清除能力的變化

超氧自由基在活性氧物質如H2O2、單線態氧的形成中起重要作用，主要損害細胞膜，包括血管內皮細胞膜及亞微結構，并引起一系列有害的生化反應[14]。如圖1所示，百合酵素的超氧自由基清除能力在發酵初期出現波動后，于發酵30 d時顯著提高(P<0.05)，并保持緩慢上升的趨勢，在發酵70 d達到最高后保持穩定，發酵90 d時為91.83 %，相較發酵初期提升27.02 %，說明延長發酵時間有利于百合酵素對超氧自由基清除能力的提高。蔣增良等[15]研究發現,葡萄酵素自然發酵過程中對超氧自由基的清除能力呈先增加后略微降低再增加的趨勢，第56天時達到最大，清除率為65.22 %，相較發酵前增加了12.8 %。

圖1 發酵過程中超氧自由基清除能力的變化Fig.1 Changes in superaxide radical scavenging ability during fermentation注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.1.2 發酵過程中羥自由基清除能力的變化

羥自由基是生物體內極具反應性的自由基，它幾乎能與活細胞中任何生物大分子發生反應，且反應速度極快，在自由基病理學上被認為具有高度的損傷性[16]。圖2表明，百合酵素的羥自由基清除能力在發酵5～30 d先升高后降低，于發酵40 d時顯著上升達到最高(P<0.05)，為55.72 %，相較發酵5 d時提高414.49 %，隨后下降至42.50 %并趨于穩定。陳嶺等[17]對石斛花發酵液發酵過程中羥自由基清除能力進行測定，發現56 d時清除能力最高，達到43.5%。羥自由基清除能力的提高可能是酵素中有機酸、多糖等物質綜合作用的結果，包永春[18]通過分析發現，乳酸、蘋果酸和酒石酸均具有清除羥自由基的能力；也有研究表明酵母壁上的多糖具有一定的羥自由基清除能力[16]。

圖2 發酵過程中羥自由基清除能力的變化Fig.2 Changes in hydroxyl radical scavenging ability during fermentation

2.1.3 發酵過程中DPPH自由基清除能力的變化

DPPH是一種穩定的有機氮自由基，在乙醇溶液中顯深紫色，能吸收抗氧化物的電子而引起樣品顏色的改變，其褪色程度與接受電子數成正比[19]。DPPH自由基清除能力是評價抗氧化性的常用方法，實驗驗證其具有良好的敏感性[20]。如圖3所示，百合酵素的DPPH自由基清除能力在15～25 d由31.19 %迅速上升至66.21 %(P<0.05)，增幅達到112.31 %，之后變化幅度減小，并呈先上升后下降的趨勢(P<0.05)，于發酵60 d時達到最高的78.93 %，90 d時下降至66.20 %。周偏等[21]研究表明諾麗酵素在自然發酵過程中DPPH自由基清除能力在54 d時達到峰值，為71.22 %，與本實驗研究結果相似。

圖3 發酵過程中DPPH自由基清除能力的變化Fig.3 Changes in DPPH radical scavenging ability during fermentation

2.1.4 發酵過程中ABTS自由基清除能力的變化

由圖4可知，百合酵素的ABTS自由基清除能力在發酵5～50 d呈不規則變化，且變化明顯；發酵50 d后呈先升高后降低的變化趨勢(P<0.05)，于發酵70 d時達到最高，為35.18 %，相較發酵5 d時提高了188.12 %，可見發酵時間對百合酵素的ABTS自由基清除能力有較大影響。陳小偉等[22]發現延長發酵時間有利于提高咖啡果皮酵素對ABTS自由基的清除能力，發酵第48天時達到91.74 %，與本研究結果不同。ABTS自由基是一種過氧化氫酶的底物，羅澤江等[14]研究表明，有機酸、維生素和酚類物質具有清除ABTS自由基的能力，其作用取決于分子質量、芳香環數量和羥基取代基等。

圖4 發酵過程中ABTS自由基清除能力的變化Fig.4 Changes in ABTS radical scavenging ability during fermentation

2.1.5 發酵過程中還原力的變化

由圖5可知，百合酵素的還原力在發酵15～30 d出現波動后，隨發酵進行持續上升(P<0.05)，于發酵60 d時達到最高的0.96，相較發酵5 d時增加了122.48 %，之后略有降低(P<0.05)，但在發酵90 d時回升至0.94。還原力的大小不僅與自由基的清除有關，還與過氧化物降解等因素有關[23]。可見發酵時間增加有利于提升百合酵素的還原力。蔣增良等[15]試驗結果與本研究相似，葡萄酵素的還原力在自然發酵過程中呈上升趨勢，在56 d后達到 0.367，與未發酵之前相比，提高了17.2 %。

圖5 發酵過程中還原力的變化Fig.5 Changes in reducing power during fermentation

2.2 百合酵素發酵過程中有機酸的變化

圖6為有機酸標準品HPLC色譜圖，圖7、圖8分別為發酵5 d和90 d時百合酵素樣品有機酸HPLC色譜圖，由圖6～圖8可知，百合酵素共含有8種有機酸，抗壞血酸、馬來酸和沒食子酸未檢出。百合酵素的總有機酸含量隨發酵進行持續上升(P<0.05)，至發酵60 d時達到(16.642±0.58) g/L，相較發酵5 d時的(5.670±0.02) g/L增長193.50 %，90 d時下降至(15.266±0.30) g/L。草酸、L-蘋果酸、莽草酸、乳酸、醋酸、琥珀酸含量在發酵過程中的變化趨勢類似，均隨發酵時間增加顯著升高，至60～80 d達到最高后趨于穩定或略有下降，發酵90 d時其含量較5 d時分別提高194.50 %、44.58 %、31.77 %、133.46 %、207.83 %和2 938.67%；而L-酒石酸和檸檬酸含量呈不規則變化。發酵過程中，乳酸、醋酸的含量遠高于其他種類有機酸(P<0.05)，發酵90 d時分別為(5.347±0.21) g/L和(4.179±0.07) g/L，占總有機酸含量的62.40 %。發酵各時段不同有機酸含量平均值排序為：乳酸>醋酸>L-蘋果酸>琥珀酸>草酸>檸檬酸>莽草酸>L-酒石酸。

1-草酸，2-L-酒石酸，3-L-蘋果酸，4-莽草酸，5-抗壞血酸，6-乳酸，7-醋酸，8-檸檬酸，9-琥珀酸，10-馬來酸，11-沒食子酸圖6 有機酸標準品的HPLC色譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of organic acids standard

圖7 發酵5 d百合酵素樣品有機酸的HPLC色譜圖Fig.7 Organic acids HPLC chromatogram of lilium Jiaosu after 5 d fermentation

圖8 發酵90 d百合酵素樣品有機酸的HPLC色譜圖Fig.8 Organic acids HPLC chromatogram of lilium Jiaosu after 90 d fermentation

表1 百合酵素發酵過程中有機酸含量變化 單位：g/L

注:同列數據末尾不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；同行數據末尾不同數字表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 發酵過程中有機酸變化時間特性的聚類分析

采用類間平均鏈鎖法(between groups linkage)對百合酵素不同發酵時間的有機酸含量進行聚類分析，結果如圖9所示，在歐式平方距離15處，12個不同發酵時間的百合酵素樣品可以聚為3類。第1類發酵階段為5～10 d，其特點是百合酵素的有機酸含量處于較低水平，可能是發酵初期微生物還處于適應期，破解細胞壁的酶類物質及代謝產生的有機酸較少[22]；第2類發酵階段為15～60 d，其特點是隨發酵時間延長,有機酸含量顯著上升，可能是因為隨著植物材料的降解，環境中的營養物質更為豐富，產酸微生物大量繁殖而生成乳酸、醋酸等次生代謝產物；第3類由70、80、90 d組成，聚集了有機酸含量較高且變化趨于平緩的階段，可能原因是糖類物質大量消耗，使產酸菌利用有機酸等營養物質進行生長繁殖[23]。

圖9 百合酵素發酵時間聚類樹狀圖Fig.9 Dendrogram obtained from clustering analysis of fermentation time of lilium Jiaosu

2.4 發酵過程中有機酸種類特性的聚類分析

對百合酵素發酵過程不同種類有機酸進行聚類分析，結果如圖10所示，在歐式平方距離15處，8種有機酸可以分為2類。第1類由L-蘋果酸、醋酸、草酸、琥珀酸、莽草酸和乳酸組成，聚入此類的有機酸含量較高或中等，發酵過程中總體呈明顯上升趨勢；第2類由L-酒石酸和檸檬酸組成，其特點是屬于低含量有機酸，且隨發酵進行呈不規則變化。

圖10 百合酵素有機酸種類聚類樹狀圖Fig.10 Dendrogram obtained from clustering analysis of organic acid species of lilium Jiaosu

2.5 有機酸含量與體外抗氧化活性的相關性

根據表2，百合酵素發酵過程中5種體外抗氧化性指標均與乳酸和L-蘋果酸含量呈極顯著正相關(P<0.01)，其中還原力、DPPH自由基清除能力和超氧自由基清除能力與乳酸和L-蘋果酸含量呈極強相關性(相關系數0.819～0.902)；除ABTS自由基清除能力外，其余4種體外抗氧化性指標均與草酸、醋酸含量具有極顯著的正相關(P<0.01)，其中，還原力、DPPH自由基和超氧自由基清除能力與草酸和醋酸含量呈極強相關性(相關系數0.849～0.945)。說明發酵過程中乳酸、醋酸等對百合酵素體外抗氧化性有明顯作用。

表2 有機酸與抗氧化活性之間的相關系數Table 2 Correlation coefficients between organic acids and antioxidant activity

注：ABTS-ABTS自由基清除能力；DPPH-DPPH自由基清除能力；HR-羥基自由基清除能力；SR-超氧自由基清除能力；RP-還原力;**表示在0.01水平上呈極顯著性相關，*表示0.05水平上呈顯著性相關。

3 結論

目前關于百合酵素的研究鮮有報道，本文對百合酵素發酵過程有機酸及體外抗氧化活性變化進行分析，結果表明，發酵過程中超氧自由基清除能力和還原力總體呈上升趨勢，羥自由基和DPPH自由基清除能力呈先上升后下降的趨勢，ABTS自由基清除能力呈不規則變化。百合酵素有機酸組成及含量豐富，以乳酸和醋酸為主，此外還含有草酸、L-酒石酸、L-蘋果酸、莽草酸、檸檬酸及琥珀酸；除L-酒石酸和檸檬酸含量呈不規則變化外，其余各有機酸總體變化趨勢相同，均隨發酵進行上升，60～80 d達到最高后趨于穩定或降低。在類間距離15處，聚類分析將發酵過程分為3類，即適應期、增長期和平緩期；將有機酸分為2類，即呈上升趨勢且含量較高的有機酸，以及呈不規則變化的有機酸；聚類分析的結果較好地反映出發酵過程各類有機酸的差異性，為百合酵素發酵階段的調控提供了良好的理論參考。相關性分析表明，發酵過程中乳酸、醋酸等有機酸是影響百合酵素抗氧化活性的重要因素，但百合酵素中可能同時存在多糖、游離氨基酸等活性物質，因此有必要對百合酵素中有機酸與其他功能成分的聯合抗氧化作用進行研究。食用植物酵素的傳統制備工藝采用自然發酵，屬混菌發酵過程，除以純培養方法獲取個體優勢菌種外，有必要開展對發酵過程微生物整體群落結構及演替規律的研究，明確對有機酸變化起主導作用的核心微生物菌群，為百合酵素發酵階段的理性調控提供理論基礎。