泡菜源屎腸球菌Enterococcus faecium R2的環境脅迫耐受性及安全性評價

陳志娜，裴紀柳，葉韜,2，薛詠振，詹志強，李雅，劉天

1 (淮南師范學院 生物工程學院，安徽 淮南，232038) 2 (資源與環境生物技術安徽普通高校重點實驗室，安徽 淮南，232038)

屎腸球菌(Enterococcusfaecium)是革蘭氏陽性球菌，屬腸球菌屬，菌落形態呈卵圓形，在其培養過程中會產生大量的乳酸，是一種兼性厭氧的乳酸菌，廣泛分布于人體和動物腸道中，是腸道中的正常菌群[1]，具有耐酸、耐熱、腸道黏附能力強等特點，還具有抑制病原菌、增強免疫力等作用[2]。相對于需要嚴格厭氧培養、保存條件極為苛刻的雙歧桿菌和乳桿菌來說，屎腸球菌的生長特性決定其是便于工業化生產和畜牧業使用的首選菌種之一[3]。屎腸球菌廣泛存在于傳統乳制品[3-5]、泡菜[6]、豆醬[7]、香腸[8]等發酵食品中，可以影響食品的香氣、風味、質地，還能產生多種有益成分[9]。但是腸球菌屬是臨床上一種條件致病菌，可引起呼吸道、泌尿生殖道、腹腔等部位的感染[10-11]。引起感染的主要原因是因為腸球菌屬含有毒力因子和比較廣泛的耐藥性[12]。多重耐藥菌株往往導致嚴重的感染，不能很好地治愈，特別是萬古霉素耐藥腸球菌在公共衛生方面產生的問題[13]。因此，屎腸球菌在應用之前必須要對其進行安全性評價。

實驗室前期從發酵泡菜中篩選出1株產酸能力較強的菌株屎腸球菌R2，該菌株可用于酸漿豆腐及豆干等的生產[14]，減少致病菌及雜菌含量，保證酸漿的質量及穩定性，進而提高豆制品的安全性。屎腸球菌R2在發酵黃漿水的過程中無需補充蔗糖、葡萄糖等碳源，且在發酵結束后無需補充醋酸即可達到適宜的酸度，有效地降低了生產成本[15]，因此，屎腸球菌R2作為一種新型酸漿純種發酵劑，對于黃漿水的開發利用及酸漿豆腐的規范化生產具有重要意義。為了更好地利用該菌株，保證酸漿豆制品的安全性，本研究通過毒力基因和耐藥基因篩查實驗，有害代謝產物檢測實驗，確定該菌株是否具有安全性；通過對外界環境耐受性和生理功能特性實驗，確定該菌株的耐受性，為屎腸球菌R2應用于酸漿豆腐生產奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

屎腸球菌EnterococcusfaeciumR2，CGMCC No.14944(專利保藏菌種)、屎腸球菌(E.faecium)CICC 24252，購自中國工業微生物菌種保藏管理中心，作為陽性對照菌；細菌基因組DNA快速抽提試劑盒、牛膽鹽、PCR反應相關試劑，上海生工；成品血瓊脂培養基、對二氨基苯甲醛、L-賴氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸、L-酪氨酸、L-鳥氨酸，國藥集團化學試劑有限公司。

MRS培養基(g/L)：蛋白胨10，酵母浸粉5，K2HPO42，檸檬酸二銨2，葡萄糖 20，牛肉膏10，CH3COONa 5，MgSO40.2，MnSO40.05，瓊脂粉 20，CaCO320，吐溫-80 1 mL。

氨基酸培養基(g/L)：蛋白胨5，酵母膏3，葡萄糖1，1.6%溴甲酚紫-乙醇溶液1，pH 6.8，分別添加0.5%(質量分數)的酪氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸配成5組氨基酸培養基。

硝酸鹽培養基：在1 000 mL的MRS培養基中加入KNO40.2 g，加熱攪拌至完全溶解，調節pH至7.4，配制成硝酸鹽培養基。

1.2 儀器與設備

LDZW-60KCS-Ⅱ立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械；SW-CJ-2D雙人單面垂直凈化工作臺，蘇州博萊爾凈化設備有限公司；，EX Zone2電子天平，深圳安普特電子科技有限公司；BSC-250恒溫恒濕培養箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠；GZX-DH500-BS-Ⅱ電熱恒溫干燥箱，上海躍進醫療器械廠； pHS-3C pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；ABI型PCR儀，美國ABI公司；GEL DOC XR凝膠成像系統， 美國Bio-rad；5804R型離心機，Eppendorf公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 安全性評價

1.3.1.1 毒力基因檢測

將屎腸球菌R2接種到MRS培養基中，37 ℃下靜置培養16 h，離心收集沉淀，按照細菌基因組DNA快速抽提試劑盒方法提取屎腸球菌R2基因組DNA。以基因組DNA為模板，用PCR擴增屎腸球菌R2的毒力基因，毒力基因的引物序列如表1所示，引物均由安徽滁州通用生物系統(安徽)有限公司合成。RCR反應體系：10 μmol/L上下游引物各1 μL、模板DNA 1 μL、2×Taq PCR StarMix 10 μL、補充ddH2O 至25 μL，設陰性對照。退火溫度分別為52 ℃(gelE和efaA)、56 ℃(cylA、asa1和esp)、58 ℃(hyl)。其余PCR條件為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，退火30 s，72 ℃延伸1min，共35個循環，最后72 ℃充分延伸5 min。PCR結束后，將擴增產物置于含EB的1.0%(質量分數)瓊脂糖凝膠中進行電泳，并拍照分析。

1.3.1.2 耐藥性基因檢測

以基因組DNA為模板，PCR擴增屎腸球菌R2的萬古霉素耐藥基因，耐藥基因的引物序列如表2所示，引物均有安徽滁州通用生物系統(安徽)有限公司合成。RCR反應體系：10 μmol/L上下游引物各1.0 μL、模板DNA 1.0 μL、2×Taq PCR StarMix 12.5 μL、補充ddH2O 至25 μL。陰性對照模板以1.0 μL ddH2O代替。PCR條件為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1min，共30個循環；最后72 ℃充分延伸10 min；4 ℃保存。PCR結束后，將擴增產物置于含EB的1.0%瓊脂糖凝膠中進行電泳，并拍照分析。

表1 六種常見毒力基因引物序列Table 1 Sequences of six common virulence genes

表2 耐藥基因引物序列Table 2 Sequences of vancomycin resistant genes

1.3.1.3 有害代謝產物檢測

氨基酸脫羧酶檢測實驗:無菌條件下，將活化后的屎腸球菌R2菌懸液按3%接種量分別接入5組氨基酸培養基中，37 ℃靜置培養24 h和48 h，觀察培養顏色變化[20-21]，以MRS培養基作為對照組。

硝酸鹽還原酶檢測實驗:無菌條件下，將活化后的屎腸球菌R2菌懸液按3%的接種量接入到硝酸鹽培養基中，37 ℃靜置培養48 h后，先滴加10滴5%(質量分數)的KI溶液，再滴加10滴5%(質量分數)的淀粉溶液，充分振蕩混勻后觀察培養基顏色變化[22]，以不接菌的培養基作為對照組。

吲哚實驗：在無菌條件下，將活化后的屎腸球菌R2菌懸液按3%接種量接入到蛋白胨水培養基中，37 ℃培養48 h后，向培養基中加入2 mL乙醚，充分振蕩，靜置片刻，使乙醚浮于上層液面，此時再沿管壁緩慢加入10滴吲哚試劑(切勿搖動)，觀察兩層交界處顏色變化[23]，以不接菌的培養基作為對照組。

溶血實驗：在無菌條件下，用滅菌后的接種環挑取活化后的屎腸球菌R2菌懸液在血瓊脂平板上劃線，倒置放入37 ℃培養箱培養48 h后，觀察菌落周圍有無溶血圈，拍照記錄反應現象。若在菌株菌落周圍的瓊脂顯示綠色，則為α-溶血；在菌落周圍出現透明圈，為β-溶血；如果對溶血無作用或不溶血，為γ-溶血[24-25](用金黃色葡萄球菌作為陽性對照組進行比較)。

1.3.2 環境脅迫耐受性

1.3.2.1 耐酸性

將活化后的屎腸球菌R2按3%接種量接分別接種到pH為2.0、2.5、3.0、3.5的MRS液體培養基中，置于37 ℃恒溫培養箱中靜置培養，分別在 0、1、2、3 h處取樣，采用平板菌落計數法測定樣品中的菌體數量[25-26]。以未經調整過的MRS液體培養基(pH約為6.8)作為對照。

1.3.2.2 膽鹽耐受性

將活化胡的屎腸球菌R2按3%接種量分別接種到含有0.1%、0.2%、0.3%、1.0%、2.0%(質量分數)牛膽鹽的MRS液體培養基中，37 ℃靜置培養3 h后，采用平板菌落計數法測定樣品中的菌體數量。以不加膽鹽的MRS液體培養基作對照，計算存活率。存活率計算如公式(1)：

(1)

式中：N1為處理組的細菌數；N0為對照組的細菌數。

1.3.2.3 耐高鹽評價

將活化后的屎腸球菌R2按3%接種量分別接種到含有1%、2%、3%、4%、5 % NaCl的MRS液體培養基中，37 ℃靜置培養24 h后，采用平板菌落計數法測定樣品中的菌體數量[26]。以不含NaCl的MRS液體培養基作為對照。

1.3.3 生理特性評價

1.3.3.1 自聚集性

將活化后的屎腸球菌R2在3 000 r/min下離心 10 min，蒸餾水洗滌2次，再懸浮，用蒸餾水稀釋，調整OD值在660 nm下為 0.3(記為OD0)。在37 ℃下孵育60 min后，再次測量660 nm下的OD值(記為OD60)[26]。自聚集計算如公式(2)：

(2)

1.3.3.2 疏水性

采用碳氫化合物黏著法。取活化好的屎腸球菌R2菌液，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌2次。生理鹽水作空白對照，用生理鹽水調整菌體濃度，使A560nm值約為1.00。取2 mL調整后的菌液，加入2 mL二甲苯，渦旋振蕩2 min后室溫靜置 180 min，使得有機相跟水相明顯分界。取水相，在560 nm波長下測定吸光值[27]。疏水率如計算公式(3)：

(3)

式中：A0和A分別是二甲苯混勻前、混勻后菌液在560 nm波長下測得的A值。

1.4 數據處理

使用SPSS 16.0軟件中的AVOVA單因素方差分析及LSD多重檢驗(P<0.05)，對數據進行統計處理和方差顯著性分析，數據表示為平均值±標準偏差表示。

2 結果與分析

2.1 屎腸球菌R2的安全性評價

2.1.1 毒力基因檢測

屎腸球菌R2的毒力基因檢測結果如圖1所示，結果表明，屎腸球菌R2不攜帶腸球菌常見的6種毒力基因，而陽性對照菌(屎腸球菌CICC 24252)檢測到了esp基因，esp基因對應的毒力因子是腸球菌表面蛋白，主要起到黏附宿主細胞的作用[16]。

M-DL 2000 Marker；1、2、3、4、5、6-gelE、esp、asa1、 cylA、 efaA、hyl的檢測結果a-陽性對照菌(E. faecium CICC 24252)；b-受試菌屎腸球菌R2圖1 屎腸球菌R2的毒力基因擴增電泳圖譜Fig.1 Specific amplified results of virulence genes fromE. faecium R2

2.1.2 耐藥基因檢測

前期藥敏性實驗結果顯示屎腸球菌R2對四環素、萬古霉素、青霉素及鏈霉素4種常見抗生素藥物敏感[15]。大量研究表明屎腸球菌引起的感染非常依賴萬古霉素耐藥性，因此進一步對屎腸球菌R2的萬古霉素耐藥基因進行檢測，結果如圖2所示，結果表明，屎腸球菌R2的vanA、vanB、vanC、vanC2/3、vanD、vanE和vanG基因擴增均為陰性。

M-DL 2000 Marker；1、3、5、7、9、11、13-受試屎腸球菌R2的vanA、vanB、vanC、vanC2/3、vanD、vanE和vanG的檢測結果；2、4、6、8、10、12、14-陽性對照菌(E. faecium CICC 24252)的vanA、vanB、vanC、vanC2/3、vanD、vanE和vanG的檢測結果圖2 屎腸球菌R2的萬古霉素耐藥基因擴增電泳圖譜Fig.2 Specific amplified results of vancomycin resistant genes from E. faecium R2

2.1.3 有害代謝產物檢測

吲哚實驗可以檢測菌株是否能分解蛋白質中的色氨酸。色氨酸為人體必需氨基酸，參與人體蛋白質合成、調節免疫功能和促進消化。色氨酸代謝過程發生障礙會引起肝功能衰退、惡性腫瘤等[28]。吲哚實驗結果顯示為陰性(見表3)，向培養好的菌液中滴加指示劑，沒有紅色圓環產生，說明沒有產生吲哚類物質，表明屎腸球菌R2不會分解色氨酸產生吲哚。

硝酸鹽還原酶能夠催化硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，而亞硝酸鹽是強致癌物亞硝胺的前提物質，與食品中蛋白質分解的中間產物仲胺反應形成亞硝胺，后者可又發胃癌、肝癌、咽喉癌等多種癌癥[29]。結果顯示菌液均未變藍，為陰性反應(見表3)，說明屎腸球菌R2的代謝產物中不含有硝酸還原酶或硝酸還原酶無活性。

一些乳酸菌具有氨基酸脫羧酶活性，能夠將食品中的氨基酸脫羧還原成生物胺類物質，如果胺類在體內積累過多，就會引起中毒的癥狀。而具有氨基酸脫羧酶的細菌，能夠分解氨基酸使其脫羧生成胺(賴氨酸→尸胺，鳥氨酸→腐胺，精氨酸→精胺)和二氧化碳，進而使培養基變堿性，當滴加指示劑(溴甲酚紫)，呈黃色為陰性，呈紫色為陽性[27]。實驗結果顯示測定管呈黃色(見表4)，為陰性，說明屎腸球菌R2的代謝產物中不含有氨基脫羧酶，即對人體無害。

表3 有害代謝產物實驗結果Table 3 The results of harmful metabolites

溶血現象是人體內一種不正常的現象，溶血素生產能力越強，紅血球破壞越嚴重，溶血現象就越嚴重，人體一旦感染，就會造成非常嚴重的敗血癥，因此溶血現象是乳酸菌安全性評價的重要檢測指標之一。如圖3所示，屎腸球菌R2在血平板上培養48 h后長出乳白色菌落且沒有溶血圈，屬于沒有毒性的γ-溶血，說明該菌株對溶血無作用或不溶血，而金黃色葡萄球菌則表現出β-溶血。

a-屎腸球菌R2；b-金黃色葡萄球菌圖3 溶血實驗檢驗結果Fig.3 The result of hemolysis test

2.2 屎腸球菌R2的環境脅迫耐受性

2.2.1 耐酸性實驗

人體胃液pH的大小根據飲食結構的不同而變化，通常維持在3.0左右。空腹或食用酸性食品后pH可達到1.5，食用堿性食品后pH可達到4～5，食物通過胃的時間一般為1～2 h。表4為屎腸球菌R2在不同pH條件下培養不同時間的活菌數。由表4可知，屎腸球菌R2在pH 6.8(對照組)和pH 3.5的MRS培養基中進行培養時，活菌數隨著培養時間的延長而增加，但是與對照組相比，pH 3.5的培養基中屎腸球菌R2的活菌數有所下降；在pH為2.0、2.5和3.0的MRS培養基中培養時，活菌數隨著培養時間的延長而降減少。

由表4可以看出，即使在pH 2.0的培養基中培養3 h后，屎腸球菌R2的活菌數仍然保持在108CFU/mL以上，而益生菌在人體內發揮作用的濃度要求一般為106～109CFU/mL。由此可知，屎腸球菌R2對人體生理濃度范圍內的酸性變化有較好的耐受性。

表4 屎腸球菌R2在不同酸度條件下的存活數Table 4 Survival of E. faecium R2 in different acidic environments

注：同列肩標字母不同表示差異顯著(P<0.05)，表5、表6同。

2.2.2 耐膽鹽實驗

小腸是益生菌發揮作用的重要場所，正常人體小腸中膽汁的質量分數一般在0.1%～0.3%。實驗結果如表5所示，屎腸球菌R2在含有質量分數為0.3%膽鹽的培養基中培養3 h后，存活率為91.95%；在含有質量分數為1.0%和2.0%膽鹽的培養基中培養3 h后，仍有82%以上的存活率。可見，屎腸球菌R2對膽鹽具有很強的耐受能力。

表5 屎腸球菌R2在不同膽鹽濃度下的存活率Table 5 Viability of E. faecium R2 under different bile salt concentrations

2.2.3 耐高鹽實驗

人體腸胃道中NaCl質量分數一般在1.0%～4.0%。NaCl的質量分數變化會影響滲透壓的大小，微生物對于滲透壓的耐受能力是有限的，滲透壓過高會造成微生物停止生長甚至死亡[30]。屎腸球菌R2在不同NaCl質量分數的培養基中培養24 h后的活菌數如表6所示，NaCl質量分數在4.0%以下，屎腸球菌R2的活菌數隨著NaCl質量分數的增加而增加，當NaCl質量分數為4.0%時，活菌數達到了109CFU/mL以上。當NaCl質量分數為5%時，屎腸球菌R2的活菌數明顯下降(P<0.05)，但仍然維持在108CFU/mL以上。由此可見，屎腸球菌R2具有較強的耐高鹽能力，在胃腸道的高鹽環境中能夠有效地消除高滲透壓所帶來的不利影響，可以維持菌體滲透壓的相對平衡。

表6 屎腸球菌R2在不同鹽濃度下的存活數Table 6 Survival of E. faecium R2 in different salt concentraion

2.3 屎腸球菌R2的生理特性

自聚集是生物膜形成的一個重要特性，而乳酸菌的生物膜可以通過保護胃腸道轉運中的菌株，產生某種抗菌化合物和刺激免疫應答從而進行腸道定植[29]，因此，自聚集性可以反映細菌的黏附性能。屎腸球菌R2菌懸液在37 ℃條件下孵育60 min后，它的自聚集性為15.94%。同樣條件下，田原等[31]測定的副干酪乳桿菌L1的自聚集性為15.8%，與本實驗結果相近；任大勇[32]測定的鼠李糖乳桿菌GG孵育在120 min后自聚集性可達到33%。由此可知，屎腸球菌R2具有一定的自聚集性。PEREZ等研究表明，菌株疏水性的大小來推斷其黏附能力的高低，疏水性在細菌發揮黏附作用和自聚集反應中都具有重要作用，即疏水性高的菌株對腸上皮細胞的黏附作用就強，且這種關聯呈現一定的依賴性[33]。屎腸球菌R2菌懸液的疏水性為7.31%，可以看出該菌具有一定的疏水性，但相對偏低。

3 結論與討論

屎腸球菌是人和動物腸道內的正常菌群，并廣泛存在于許多傳統發酵食品中。腸球菌具有蛋白酶、脂肪酶活性及產生二乙酰等代謝能力，在奶酪加工、發酵肉類的后熟和產品的特殊風味及香氣形成中發揮重要作用[34]。有些屎腸球菌可以產生腸球菌素，可以抑制奶酪表面單增李斯特菌的生長和繁殖，對奶酪的保鮮具有一定效果[7]。另外，屎腸球菌生物學特性良好，對于高溫、高鹽、酸堿和氧氣具有較好的抗逆性，董曉芬等[35]從枳椇果梗中篩選出一株富硒能力強且適宜發酵枳椇液的屎腸球菌，可耐受pH 2.5的酸和0.3%(質量分數)膽鹽。此外，有報道表明厭氧條件下屎腸球菌E.faeciumEPI1與LactobacillusmucosaeEPI2等菌株混合發酵可產生雌馬酚[36]，雌馬酚為大豆異黃酮代謝終產物，具有比其他異黃酮類物質和其前體物質大豆苷元更強的類雌激素活性。實驗所用菌株屎腸球菌R2具有α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶活性，可代謝豆腐黃漿水中的棉籽糖和水蘇糖，同時將活性低的糖苷型大豆異黃酮(主要為大豆苷和染料木苷)轉化為高活性游離型苷元大豆異黃酮，對改善豆制品的品質具有重要的意義。

本實驗通過對屎腸球菌R2的安全性評價可知，該菌在毒力基因檢測和萬古霉耐藥基因篩查實驗中，實驗結果均為陰性；在有害代謝產物檢測實驗中，實驗結果也均為陰性，且為無毒的γ-溶血；且該菌對外界環境中的酸性、膽鹽及高滲透壓耐受性良好，也體現了一定的聚集性和疏水性，因此，屎腸球菌R2表現了良好的安全性和環境耐受性，具有潛在的應用前景。