間充質干細胞治療的生物安全研究進展

曾貴榮，楊 柳，羅桂芳，姜德建

(湖南省藥物安全評價研究中心&新藥藥效與安全性評價湖南省重點實驗室，長沙 410331)

近年來，隨著老齡化社會的加快，骨質疏松癥、神經退行性疾病、糖尿病等與年齡相關的疾病發病率逐年攀升，給醫學和生命科學帶來了巨大挑戰，目前以化學藥物和手術治療為支柱的傳統西醫治療逐漸遭遇瓶頸，而以干細胞技術為核心的再生醫學快速發展并走上臨床應用，為人類衰老性疾病治療注入了新的希望和活力[1-7]。據ClinicalTrials.gov統計，全球210多項間充質干細胞處于臨床研究[8]，主要集中于傷口愈合，骨骼肌、心血管、肝腎疾病、腫瘤、神經退行性疾病和自身免疫性疾病以及器官移植等。然而間充質干細胞的生物安全限制了其臨床的應用，主要表現在人體內的間充質干細胞較少，無法分離后直接輸入體內用于細胞治療[9]，且臨床治療需要滿足以下條件[10]：充足的細胞量，分化成特定的細胞，輸注后受體中細胞存活且有效，移植后對受體安全。相應地，細胞治療包括供體選擇、間充質干細胞分離、培養擴增、臨床前、臨床療效和安全性評價、移植等過程[11]，其中任何一個環節存在問題都將影響治療的安全和療效。作為一種新的治療形式，間充質干細胞生物安全是細胞治療能否進入臨床應用，保障患者生活質量的關鍵問題。因此系統的綜述目前間充質干細胞生物安全有助于促進間充質干細胞治療的發展與應用。本綜述從間充質干細胞遺傳穩定性、致癌性、免疫原性等方面闡述間充質干細胞治療的生物安全研究進展，為降低間充質干細胞治療風險提供參考。

1 干細胞及間充質干細胞概述

干細胞是一種未完全分化的、具有自我增殖和高度分化潛能的細胞。根據來源和分化增殖能力不同，將干細胞分成多能胚胎干細胞、人誘導多能干細胞和多能成體干細胞等三大主要細胞類型[1]。干細胞具有非常強的分化能力，在特定條件下可被分化成神經元、心肌細胞、肝細胞、成骨細胞等多種細胞，移植進入機體可替換損傷組織或產生修復因子促進組織再生[2]，干細胞的分化能力極大地推動了再生醫學的發展和退行性疾病的治療，具有傳統化學藥物、生物藥物不具備的優勢。

間充質干細胞是一種來源于中胚層具有自我復制更新和多向分化的多能干細胞，具有獨特的免疫表型和免疫調節能力，屬于多能成體干細胞。相對于多能胚胎干細胞、人誘導性多能干細胞，它的分化和增殖能力較弱[3]。自上世紀六七十年代，Friedenstein研究組首次發現一群位于動物骨髓細胞中的邊緣細胞群具有成骨能力，起初被定義為貼壁集落形成單元成纖維細胞[4]。因這群細胞可生成骨骼組織相關的細胞，被認為是干細胞，也有稱為造血干細胞或間質細胞體外培養的飼養細胞。基于細胞的功能演化成成骨干細胞或骨髓間質細胞。此外，這一細胞在包括人類在內的其他物種中得以證實。隨后，為適應起源于胚胎中胚層細胞的概念，Caplan等[5]首次提出“成年間充質干細胞”這一概念，并被科學家和臨床醫生廣泛應用。

間充質干細胞來源于多種人體組織，最主要的來源為骨髓和脂肪組織[1]。也可從臍帶血、胎盤、羊膜、牙髓、腦、子宮內膜、皮膚、鼻粘膜等組織分離獲得間充質干細胞。它不僅可直接分化成組織特異性細胞修復傷口而且可通過釋放抗炎細胞因子、抗凋亡和生長因子的旁分泌的形式刺激組織修復，被認為是組織工程和再生醫學的強有力工具[6-7]。此外，間充質干細胞可在炎癥、腫瘤和損傷部位歸巢替代或修復損傷的組織[1]。基于其獨特優勢，間充質干細胞是細胞治療的理想候選物，在組織再生、癌癥、骨關節病等方面具有廣闊的前景。

2 遺傳穩定性及其影響因素

歐洲藥品監督管理局出臺的《關于干細胞的醫療產品的反思報告》對細胞治療產品無污染、活力、生長曲線、細胞鑒定、純度、效力和遺傳穩定性做了詳細的管理規定，特別強調遺傳穩定性是主要的安全擔憂[12]。遺傳穩定性指標表現為染色體畸變、微核異常、DNA損傷、端粒縮短、表觀遺傳失調等。遺傳不穩定與癌變密切相關，染色體核型分析是評價細胞染色體結構和數量的金標準[13]。干細胞擴增可降低DNA聚合酶和DNA修復效能進而導致細胞遺傳突變、表觀遺傳學改變、DNA雙鏈斷裂[14-15]。而DNA損傷阻滯轉錄和復制驅動細胞衰老及轉分化失常，進一步加劇組織老化和年齡相關的癌變[16-17]。

遺傳穩定性受供體、組織來源、擴增過程培養條件、儲存條件、傳代次數等影響[18]。Stultz等[19]對不同供體和代數的骨髓源性人間充質干細胞的染色體穩定性分析顯示，相比于第5、7代，第3代異常核型更多，且隨著代數增加，異常核型逐漸降低。根據供體年齡不同分成老年組(39～41歲)和年輕組(22～31歲)，發現老年組供體主要為染色體易位，而年輕組為非整倍體，但老年組與年輕組的染色體并無顯著差異，提示間充質干細胞染色體異常主要發生在早期代數，隨著傳代次數越多，染色體越趨于成熟穩定。Duarte等[20]比較了低溫保存前后對人臍靜脈間充質干細胞的染色體狀態的影響，發現液氮凍存后檢測到非克隆型染色體畸變，17個細胞中期中12個細胞顯示單體性(2個標記染色體，其他為染色體斷裂)，5個細胞染色體的結構發生改變。凍存2個月的細胞染色體3短臂臂內發生倒位。Sharma等[21]評價了高糖、缺血、缺氧、饑餓等不同培養條件下人臍帶和胎盤來源的間充質干細胞遺傳穩定性，發現突然降低氧濃度可增加核泡數量，減少細胞增殖，但未誘導衰老；而在高糖、缺血以及低氧血清饑餓下間充質干細胞遺傳保持穩定。Vinogradov等[22]采用熱休克模擬高溫環境下人子宮內膜間充質干細胞的分子遺傳特征，G帶顯示染色體隨機斷裂和非整倍體；染色體核型分析觀察到細胞無基因組不平衡現象；mRNA測序數據顯示，與對照組相比，熱休克誘導錯配，破壞DNA修復。人間充質干細胞暴露在20% O2下培養顯著增加氧化應激水平，誘導DNA雙鏈斷裂、染色體畸變、非整倍體以及端粒縮短；而3% O2的條件下培養干細胞的壽命延長，遺傳穩定性顯著增加；利用原位雜交分析人脂肪組織來源間充質干細胞的染色體8、11、17，發現低氧降低非整倍體發生率；表明低氧條件有助于增強人間充質干細胞治療的安全性[23]。

綜上可知，間充質干細胞遺傳穩定性直接影響細胞的衰老、轉分化進而可引起衰老和癌變，是干細胞治療中的主要安全問題。其遺傳穩定性主要受到擴增傳代次數、培養條件、保存環境的影響，深入研究影響間充質干細胞的遺傳穩定性機制，調整細胞培養條件并建立細胞產品制備的標準操作規程，有利于提高細胞遺傳穩定性，保障細胞治療安全。

3 致癌特性及其影響因素

致腫瘤發生是間充質干細胞臨床治療最重要風險之一。由于間充質干細胞本身的自我更新和分化潛能，長期培養能自發性轉化成其他細胞，大多數可分化成成骨細胞、軟骨細胞、心肌細胞、脂肪細胞等無害細胞，也可能分化成惡性細胞[24-25]，這是間充質干細胞的固有特性。前期研究顯示，癌癥細胞的起源和惡變與間充質干細胞特征相似，如長期的增殖、生長調控機制[26]。事實上，在一項將大量未分化的人胚胎干細胞移植到免疫缺陷小鼠觀察到畸胎瘤生長的研究報道后[27]，干細胞的致癌風險被推向了風口浪尖，給干細胞快速發展澆上了一盆冷水，警醒企業、臨床和科學界關注干細胞治療的生物安全問題。盡管迄今未見間充質干細胞形成畸胎瘤的報道，但由于它具有自我增殖、分化等與干細胞相同的特性，其致癌發生風險仍不能忽視。

干細胞的致腫瘤發生受到環境因素影響，如遺傳操作和體外培養。文獻報道，長時間培養的間充質干細胞具有致瘤發生的潛能，轉化成為高核質比、高端粒活性和高增值能力的上皮樣細胞[28-29]。此外，遺傳不穩定性與腫瘤發生密切相關[30]，如在高氧可誘導染色體畸變、DNA損傷。Conforti等研究[31]了電離輻射和饑餓應激下骨髓間充質干細胞的惡變情況，發現輻射和饑餓的間充質干細胞失去了典型的紡錘形形態、生長速率降低，但保持了正常的的免疫和分化功能，更為重要的是未表現出惡性癌變傾向。Yong等[32]評估了長期保存人脂肪來源的間充質干細胞的致瘤發生變化，發現利用低溫細胞保護劑冷凍保存3個月細胞的腫瘤抑制因子p53、p21、p16、pRb、hTERT、端粒酶活性和端粒長度未見明顯變化，DNA損傷和p53突變無顯著影響，表明長期保存脂肪來源的間充質干細胞發生腫瘤風險較低。給小鼠注射脂肪組織間充質干細胞1年后顯示，移植細胞被完全清除，未見腫瘤發生[33]。然而，研究發現將間充質干細胞移植到SCID小鼠中，觀察到腫瘤的生長現象[29]。椎管內內嗅粘液細胞自體移植8年后，一位年輕的脊髓損傷患者出現自體移植物來源的脊髓腫塊，腫塊組織學上與嗅黏膜相似[34]。2009年，文獻報道一例胎兒神經干細胞移植治療共濟失調毛細管擴張4年后發生膠質神經腦瘤，基因分析顯示腫瘤細胞來源于供體[35]。

綜上，間充質干細胞自身固有特性和培養環境是致瘤性的決定因素。腫瘤發生與免疫缺陷相關，由于間充質干細胞具有免疫抑制的作用，故間充質干細胞可能調控免疫促進腫瘤發生。盡管現有研究提示間充質干細胞移植的致瘤風險較低，但在間充質干細胞臨床應用前，仍需嚴格評估其致瘤發生潛在影響。

4 免疫原性及其影響因素

干細胞從健康志愿者分離獲得(同種異體)，也可從患者自身分選制備。在同種異體干細胞移植面臨倫理問題和免疫排異反應[36]。人間充質干細胞具有免疫調節作用[37]，當機體免疫過低時，間充質干細胞能促進炎癥。相反，免疫過度激活時，間充質干細胞抑制炎癥進而避免自身攻擊。因此，有觀點認為間充質干細胞具有免疫特權，移植時可能不會誘發免疫反應[38]。

間充質干細胞通過以下途徑發揮免疫調控作用：通過抑制分裂素、異種抗原的T淋巴細胞增殖反應，誘導初始T細胞無能，抑制調節性T細胞擴增，抑制對同種異體細胞的T淋巴細胞毒性從而抑制T淋巴細胞功能；它還可通過抑制自然殺傷細胞對病毒感染細胞的殺傷作用，抑制IL-2驅動NK細胞增殖和INF-γ釋放；此外，間充質干細胞也可下調樹突細胞共刺激分子表達，抑制單核細胞和CD34+祖細胞分化成樹突細胞，降低促炎細胞因子IL-12、INF-γ、TNF-α的釋放而增加IL-10分泌。間充質干細胞可作為抗原呈遞細胞將HLA-Ⅰ限制性病毒或腫瘤抗原加工呈遞給CD4+T細胞，釋放少量的INF-γ和顆粒酶B，但其T淋巴細胞殺傷毒性效果非常有限[39]。Klyushnenkova等[40]評估了骨髓間充質干細胞激活同種異體T細胞能力，發現異體骨髓間充質干細胞無法促進外周血T淋巴細胞增殖，但可釋放INF-γ。將間充質干細胞加入初始混合淋巴細胞共同培養觀察到間充質干細胞抑制淋巴細胞增殖，且抑制效果呈現劑量依賴性，其發生與是否進行INF-γ預處理無關，表明間充質干細胞開始可激活異體T細胞，但由于其免疫抑制作用無法引起T細胞增殖反應。以上均提示同種異體間充質干細胞具有免疫抑制作用且較低的免疫原性。

Deuse等[41]比較了人臍帶間充質干細胞和成年骨髓間充質干細胞的免疫原性，結果顯示人臍帶間充質干細胞HLA-Ⅰ 表達更低，TGF-β和IL-10生成更多，增殖更快。骨髓間充質干細胞對異體淋巴細胞激活和體內免疫活化能力更強，而人臍帶間充質干細胞免疫識別能力更弱。骨髓間充質干細胞在完全免疫小鼠顯示更快的排異反應。最近的一項研究發現同種異體間充質干細胞移植后產生了抗體和顯著的免疫排異反應[42]。體外研究顯示，大鼠間充質干細胞對異體T細胞無法激活，而INF-γ和IL-1β處理后，間充質干細胞上調MHCⅠ、Ⅱ和血管粘附分子-1，增加T淋巴細胞毒性反應。接受間充質干細胞異體移植的大鼠的免疫活化標志物CD25、CD71顯著上調，生成同種抗體促進補體介導的細胞裂解作用[43]。Huang等[44]研究了間充質干細胞分化對細胞免疫的影響，發現間充質干細胞分化成的肌原性細胞、內皮細胞和平滑肌細胞組織相容性復合體Ⅰa、Ⅱ 表達增加，Ⅰb則降低。這些細胞與異體白血球共培養后細胞毒性顯著增加。采用分化的細胞處理心肌梗死大鼠，檢測心肌功能6個月，發現移植3個月后，間充質干細胞顯著改善心室功能。而異體分化的細胞在移植后5周被完全清除，移植5個月后其療效喪失，表明間充質干細胞分化后免疫激活排斥功能增加。Liu等[45]將骨髓間充質干細胞分化的成骨細胞與異體淋巴細胞共培養顯示淋巴增殖反應，接受成骨細胞移植的新西蘭白兔表現出明顯的皮膚排異反應，該研究同樣證實了間充質干細胞分化成特定細胞可產生顯著的免疫排斥反應。

綜上，間充質干細胞具有免疫抑制作用，但不具有免疫特權。間充質干細胞異體移植需注意免疫排異反應，且其免疫排斥反應與其組織來源、分化狀態密切相關。

5 結語

間充質干細胞具有自我增殖、分化潛能、免疫調控功能，是細胞治療的理想材料，在發育和再生醫學中表現光明的前景。在間充質干細胞治療的發展過程中，其生物安全(遺傳不穩定、致腫瘤發生、免疫排異反應等)會直接影響其臨床轉化和應用，已成為制約其產業發展的主要障礙。為了推動干細胞產業迅速發展，國內外相關部門做出了許多努力，但目前對間充質干細胞的制備及其生物安全的研究國內外尚未形成統一的標準和體系，國家知識產權局甚至將干細胞與再生醫學、免疫治療等明確列為急需知識產權支持和國家重點發展的產業之一。在間充質干細胞應用前，需根據《干細胞制劑質量控制及臨床前研究指導原則》的質量控制標準、《中華人民共和國藥典》、ISCT-間充質干細胞鑒定標準(2006)，對生物安全風險因素，如微生物、內毒素、致瘤性、異常毒性、殘留性、核型異常率進行檢測，且國際細胞治療協會也制定了間充質干細胞應用于臨床試驗的放行標準，根據以上原則來降低干細胞應用的生物安全風險。未來需要深入研究間充質干細胞遺傳不穩定、致癌、免疫排異的發生機制，對間充質干細胞產品制備和臨床治療進行嚴格規范和標準化，建立質量控制和安全評估標準體系，和準則，消除存在的安全隱患，保障人類安全。