炎癥反應在心肌再生中的作用

談 勇，占貞貞

(同濟大學附屬東方醫院，上海 200120)

心肌再生是心肌受到不可逆損傷時，以心臟中已存在的心肌細胞大量增殖和冠狀血管重建為主要特征，心臟自主神經[1]以及細胞外基質共同輔助協調，使得心臟結構與功能恢復正常的再生過程(自發的心肌再生僅限于心肌細胞仍處于分裂周期的情況下)。而急性炎癥是心肌受損時的重要生理病理反應，對促進心肌再生具有重要作用。

1 哺乳動物心肌再生面臨巨大挑戰

1.1 某些魚類與兩棲動物心臟可以再生

研究者們從低等動物出發，由硬骨魚類(如斑馬魚)中脊髓、視網膜和魚鰭可以再生，思索到心肌是否也可以同樣再生，于是利用斑馬魚制作心尖切除模型，結果顯示，術后約兩個月，心室切除約20%的斑馬魚心臟完全再生，其心臟形態和功能與sham組斑馬魚對比無明顯差別[2]。通過此次研究，研究者將目光移到兩棲動物，發現某些兩棲動物心臟受損后，也可以進行心肌的完全再生[3]。

某些魚類和兩棲動物(如蠑螈)在整個一生中都具有著強大的心臟再生潛能，但成年哺乳動物卻并非如此，許多研究表明，成年哺乳動物心臟也具有一定的可測量的心肌細胞更新能力，但是并不足以使得心臟嚴重損傷時恢復其收縮功能[4]。由于成年斑馬魚心臟與未成熟哺乳動物有著許多相似性，研究者們做出大膽的假設，即新生的哺乳動物心臟可能具有心肌再生的潛能，他們對一日齡小鼠制作心尖切除模型，切除了小鼠的左心尖(約占心室心肌的15%),發現手術后約三周其心臟正常形態恢復，術后兩個月進行超聲心動檢查，確認新形成的心尖具有正常的心肌收縮能力，與sham組比較，無明顯差別，說明可以完全再生[5]。而7日齡小鼠心尖切除后無法再生，轉為纖維化，形成瘢痕。研究者們對這種情況進一步進行了研究。

1.2 新生小鼠心肌細胞可以增殖，實現心肌再生

為了確定再生的心尖是否含有新形成的心肌細胞，研究者們使用了5-溴-2-脫氧尿苷(BrdU) 進行檢測，發現再生的心尖中存在BrdU陽性心肌細胞，而相比于sham組，BrdU陽性心肌細胞在再生區域先端和邊緣區數量較多，這充分說明了新生小鼠心肌再生過程伴隨著心肌細胞的增殖。心肌細胞增殖的來源眾說紛紜，并沒有一個成熟的結論，之前研究者一直認為心肌再生主要與心臟常駐干細胞分化增殖有關，有證據表明哺乳動物心肌中存在特定數量的干細胞或祖細胞[6]，定位于特定的微環境，這些心肌干細胞被認為具有自我更新的潛能和免疫調節的關鍵特性，并且它們被假定在正常條件下以及在病理狀態下有助于心肌細胞的復制和替換[7]。Porrello他們利用遺傳命運映射方法來追蹤再生心尖心肌細胞起源的譜系，發現sham組和實驗組的心肌細胞都來源于同一個心臟譜系，這說明再生過程中增殖的心肌細胞主要來源于先前已存在的細胞。同時也發現7 d大的小鼠不再具備再生能力是因為心肌細胞一周內會變成雙核并且退出細胞周期，這與之前的研究結果相一致[8]。此外，在哺乳動物中，心臟神經支配也被證明對新生兒心肌再生至關重要，新生兒心肌細胞對損傷的反應性增殖可通過對心肌的自主神經(如迷走神經和交感神經)來介導。不僅如此，許多細胞外基質蛋白也可以促進心肌細胞的增殖，誘導心肌再生[9]。

這些研究發現了新生小鼠心臟與魚類和兩棲動物一樣，具有再生潛能但一周內會喪失這種再生潛力，而失去這種能力的原因主要與心肌細胞不再具有增殖潛力有關。因此自發心肌再生是先前已存在的心肌細胞的補償性增殖介導的，而不是內源性的心臟干細胞，且心臟神經與細胞外基質也對心肌再生發揮作用。

2 炎癥反應在心肌再生領域具有重要作用

2.1 炎癥反應參與心肌損傷后心肌再生

對非再生模型與再生模型進行比較，研究者發現巨噬細胞和嗜中性粒細胞數量存在差異[10]，再生動物模型募集到受損心肌中的嗜中性粒細胞數量較少，這可能導致促炎性細胞因子產生減少，以及降低因為嗜中性粒細胞活性引起的組織損傷[11]。非再生動物模型中巨噬細胞募集較少，可能會導致嗜中性粒細胞清除不充分從而導致基質降解增強，膠原蛋白沉積延遲以及對心臟破裂的敏感性增加[12]，而且嗜中性粒細胞保留與過度的纖維化反應有關[13]。

2.2 心臟受損后急性炎癥反應可以促進心肌再生

研究者對損傷后急性炎癥反應的作用進行了研究。通過對斑馬魚尾鰭再生的觀察，發現在損傷后炎癥階段免疫細胞發揮著重要作用，可以清除凋亡小體和小細胞碎片，有效解決炎癥并促進組織重塑和再生長[14]。之后對成年斑馬魚制作心肌受損模型，發現在抑制炎癥反應之后，會嚴重損害心肌細胞的分裂活性和再生過程[15]，這說明炎癥反應是斑馬魚受損心肌再生過程中所必需的。而成年哺乳動物中，急性炎癥反應通常被認為會促進心臟瘢痕的形成而對心肌再生產生負面影響，新生哺乳動物中產生的現象卻并非如此[5]。通過對1日齡小鼠的實驗，單獨進行急性炎癥刺激后，會促進心肌細胞增殖，并且乳鼠心臟損傷后進行免疫抑制，其心肌再生過程被終止。這說明急性炎癥刺激了乳鼠心臟的再生反應[16]。

2.3 心肌再生模型中的急性炎癥反應過程

研究者大致厘清了心臟損傷后免疫反應作用過程，在時間上大致分為促炎期和消炎/修復期[10]。

促炎期：壞死細胞會釋放相關成分，觸發無菌炎癥，這些成分包括損傷相關分子模式(damage associated molecular patterns, DAMPs)、蛋白酶、水解酶和線粒體活性氧(reactive oxygen species, ROS)。DAMP可以直接激活監視細胞(組織巨噬細胞、單核細胞和嗜中性粒細胞)以及常駐細胞(內皮細胞、成纖維細胞和心肌細胞)上的模式識別受體(pattern recognition receptor, PRR)[16-19]。蛋白酶，水解酶和活性氧激活補體系統以及炎癥小體，并降解細胞外基質(extracellular matrix, ECM)[16-19]，從而進一步傳播炎癥反應[20]。組織巨噬細胞被DAMP活化，通過分泌細胞因子來募集單核細胞和嗜中性粒細胞，浸潤的單核細胞和嗜中性粒細胞通過吞噬作用清除細胞碎片，這有助于終止最初的損傷；內皮細胞被DAMP活化以促進細胞粘附和通透性，并重塑ECM。

消炎/修復期：傷口清除后，成纖維細胞會分泌ECM，防止損傷的心臟破裂。T細胞會分化為調節性T細胞(regulatory cells, Tregs)，分泌抗炎性細胞因子(線粒體蛋白等)，而M2巨噬細胞會擴張并占據受損區域，逐漸清除嗜中性粒細胞，這些都降低了炎癥反應[21]。

2.4 免疫細胞在心肌再生中的作用

心臟損傷后的炎癥主要由壞死細胞釋放的分子觸發，并且被編程為在清除細胞碎片后得以解決。此過程在再生模型和非再生模型中均發生，但是可以觀察到其中存在的深刻差異，前者導致疤痕消退和組織補充，后者導致疤痕成熟和組織重構。這些差異至少部分歸因于再生和非再生模型中心臟駐留細胞和募集的免疫細胞的差異反應。因此有必要深入討論研究免疫細胞在心肌再生中的作用。

巨噬細胞分泌多種細胞因子和營養介質，例如白細胞介素10，成纖維細胞生長因子1和胰島素樣生長因子1[22]。而巨噬細胞吞噬凋亡細胞，有利于炎癥的解決。攝入凋亡細胞后，巨噬細胞分泌抗炎性細胞因子，從而減弱組織的炎性損傷[23]。此外，巨噬細胞也介導細胞外基質，促進成纖維細胞活化、細胞外基質降解和基質金屬蛋白酶活性的改變。巨噬細胞還與骨骼肌再生有關，其機制較為復雜，包括清除死亡細胞，分泌修復細胞因子(如胰島素樣生長因子1)，以及與骨骼干細胞的相互作用[24]。研究者發現乳鼠心臟損傷后的心肌再生和心血管生成與巨噬細胞有關，巨噬細胞耗盡之后，乳鼠無法再生心肌并形成纖維化瘢痕，導致心臟功能下降[25]。 因此，巨噬細胞在組織再生中起著關鍵作用。目前，巨噬細胞被認為促進心肌再生的一大機制是促進心血管生成(通過旁分泌作用分泌一系列細胞因子促進血管生成[26])，其次，據報道巨噬細胞可以轉分化為內皮樣細胞或內皮祖細胞，這可能也是巨噬細胞促進血管生成的關鍵[27]。巨噬細胞種類不同，也決定了是否能夠促進心肌再生。新生兒心臟對損傷的反應為擴大其常駐的修復性心臟巨噬細胞群，而成人心臟募集CCR2+促炎性單核細胞和單核細胞衍生的巨噬細胞，這種差異的后果是再生與修復[11]。近來發現，信號傳導及轉錄激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)/白介素6(interleukin- 6, IL-6)通路在成年斑馬魚[28]和乳鼠心臟[29]中介導損傷誘導的心肌細胞增殖和心肌再生，而單核細胞和巨噬細胞是IL-6及其衍生物的豐富來源[30]，這也側面證明了巨噬細胞在心肌再生過程中的重要作用。最新的報道證明，巨噬細胞可通過分泌抑癌蛋白M(OSM, oncostatin M)直接促進心肌細胞的增殖[31]。

嗜中性粒細胞在心肌再生過程中也存在著相當大的影響。心肌受損后，會導致嗜中性粒細胞迅速向損傷區域募集，并在損傷區釋放特定的警告素--S100A8和S100A9。這些物質會與Toll樣受體4(toll-like receptor 4, TLR4)結合，引發炎癥小體并促進白介素1(interleukin- 1, IL-1)分泌。釋放的IL1與其在骨髓中的造血干或祖細胞上的受體相互作用，能夠刺激粒細胞形成。通過遺傳或藥理學措施破壞S100A8/A9及其下游信號級聯能夠抑制誘導的粒細胞生成，進而改善心臟功能[32]。由此看來，嗜中性粒細胞在心肌再生過程中主要起著負面的影響，但嗜中性粒細胞也有有益的一面，它可以通過分泌過氧化物酶抑制損傷過程中的過氧化氫的爆發，在炎癥消退中起到積極作用[33]。因此，我們要充分考慮嗜中性粒細胞在心肌再生中的作用。據報道，T細胞也在心肌再生中發揮作用。調節性T細胞(Treg)可直接促進損傷后血管[34]和心肌[35]的增殖與再生。特異性耗竭CD4+T細胞也可以促進心肌再生[36]。

2.5 心臟疾病的干細胞治療

近幾十年來，干細胞技術的出現給幾乎所有人類疾病帶來了巨大的希望，最重要的是非傳染性疾病，這種疾病的特征就是器官功能障礙和退化。而在非傳染疾病中，心血管疾病無疑是干細胞的治療方法最有吸引力的目標，從僅僅改善心臟微環境，到部分再生和補償失去的功能性組織，以及完全制造出替代心臟，這三大階段，是我們對新技術的期許。

由于骨骼肌和心肌組織在胚胎和形態學上的共性，骨骼肌成肌細胞成為心肌再生早期有吸引力的研究目標之一。人們開始了幾項臨床試驗來驗證它們的功效，盡管最初報道移植有骨骼肌成肌細胞的患者的心臟參數有所改善，但之后許多患者發生了室性心律失常[37]，因此骨骼肌成肌細胞在干細胞治療方面的應用被人們放棄。表達c-kit的心臟祖細胞也被研究，因為它們在發育、新生期甚至在成人心臟中具有心肌分化潛能，但它們在心肌再生中所發揮的作用存在很大爭議。近來有研究者提出，即使在新生兒時期，c-kit陽性細胞也不能促進心肌生成[38]。目前的共識是，心臟祖細胞在成人心臟中的作用(如果有的話)僅限于維持心臟組織內環境穩定，其在損傷情況下的心肌生成潛能并不存在[39-40]。相比而言，多能干細胞治療具有更廣泛的治療潛力，且在臨床試驗也有一定的成效[41]，但需要更詳細的了解其潛能和風險。所以，目前而言，干細胞治療方面仍有許多的未知，c-kit陽性細胞是否還有潛在的作用？是否存在真正的心臟干細胞？多能干細胞衍生的心臟祖細胞在臨床治療方面如何有效規避掉移植引起的免疫抑制以及相關的并發癥的風險？

目前Vagnozzi等[42]指出，急性炎癥反應是心臟干細胞治療的基礎，它可以改變心臟成纖維細胞的活性，減少邊界區ECM的含量，并增強受傷部位的機械性能。因此，心臟干細胞治療的優勢是基于急性炎癥的傷口愈合反應，可以使心臟受損區域恢復活力，但還是無法促進心肌細胞生成。

3 未來的方向

為什么出生后的小鼠很快失去心肌再生能力?心肌細胞增殖的潛力因為什么機制的消失而消失？通過低氧[43]和降低負荷[44]等以模擬胎兒時期的環境是否有效促進心肌再生？小鼠與人體心臟心肌細胞的數量級不同是否也成為了阻礙人體心肌再生的關鍵？何種炎癥反應機制能有益于心肌細胞的再生？嗜中性粒細胞與巨噬細胞又在心肌再生中扮演了什么樣的角色？至今為止，尚無明確研究說明心肌再生過程中心肌細胞如何增殖以及瘢痕如何消退。而且，急性炎癥對于心肌再生過程是起促進作用的，但是演變為炎癥微環境就會使得心肌細胞丟失增加，形成大范圍的纖維化，這種再生過程中及時解決和抑制炎癥的能力至關重要。但是目前對于這種無瘢痕再生炎癥反應的精確的時空調節仍舊不清楚。

通過增強心肌細胞的增殖來促進心肌更新以及干細胞治療是目前實現人體心肌再生的可行的策略，而炎癥反應對二者均具有相當重要的作用，我們有理由相信，當徹底厘清炎癥反應一系列的機制時，將會在實現人體心肌再生領域邁出關鍵的一步。