高通量測序在鳥類腸道微生物中的研究進展

劉 倩，宋文濤，樊國印，熊衍文，陳海嬰1,，吳 葵

在脊椎動物中，鳥類是地球上最普遍存在的物種之一，擁有超過10 000個現存物種，也是最多樣化的物種之一[1]。鳥類的分布遍及全球，每年數以億計的鳥類在各個大洲之間持續流動，它們能夠跨越生物和地理的邊界，在廣闊的地理空間范圍內遷徙[2]。鳥類可以通過直接傳播，或作為病原體的載體，例如禽類病原體和人獸共患病病原體，也可以傳播抗生素耐藥性細菌，成為許多人類和動物疾病的感染來源[3-4]。候鳥在遷徙過程中的覓食、排泄等行為，使其更可能成為寄生蟲或其他微生物跨地域傳播的帶菌者和傳播者。由于這些特點，鳥類在微生物的傳播過程中起著重要的作用，從而影響微生物的動態，影響各種病毒和細菌的生態和進化[5]。

目前我們對鳥類腸道微生物的研究十分有限，且主要集中于一些人工養殖的經濟物種，如家雞、火雞、家鴨和鴕鳥等，野生鳥類則相對較少。早期人們對腸道微生物的研究主要通過直接從PCR擴增子構建克隆文庫進行測序，或通過指紋圖譜分析[6-7]。相對于高通量測序(High-throughput sequencing，HTS)，如454焦磷酸測序和Illumina測序平臺[8]，克隆測序和指紋技術通量低且耗時長。近年來，測序技術的進步使人們對人、鼠等哺乳動物腸道微生物的認識快速提升，但對鳥類腸道微生物的研究相對滯后。本文在簡要介紹高通量測序技術的基礎上，綜述了其在鳥類腸道微生物研究中的進展。

1 描述鳥類腸道微生物的測序策略

1.116S rDNA測序 16S rDNA 測序技術是用于常規微生物組分析的最重要的不依賴于培養的方法之一。16S rDNA是原核生物染色體中編碼核糖小亞基的DNA序列，人們根據其序列變異特點將其分為9個可變區和10個保守區[9]，其中保守區序列反映了物種間的親緣關系，而可變區序列則能體現物種間的差異。針對16S rDNA測序，主要有兩種方法：一種是以454焦磷酸測序和Illumina為代表的二代測序技術，但是受測序長度的限制，往往只能選擇1～3個可變區作為擴增片段(目前鳥類腸道菌群研究常用擴增子片段是V3～V4區)，但分類的準確性和一致性存在問題。另一種則是以PacBio和Nanopore為代表的三代測序技術，可以得到16S rDNA基因全長序列，相對于二代測序，其檢測到的物種多樣性和生態結構的復雜度更高且更準確，但測序成本相對較高且存在一定的測序錯誤率[10]。

1.2宏基因組測序 宏基因組學(元基因組學，Metagenomics)[10]是指應用高通量測序技術對樣品中存在的全部DNA含量進行測序，而與來源無關。目標樣品中包含的模板DNA可直接進行測序，而無標記基因擴增步驟。宏基因組學不僅能夠提供關于鳥類腸道內病毒的信息，而且能夠對宿主線粒體DNA進行表征，從而識別宿主物種，指示飲食偏好，并從新鮮的糞便樣本中識別細菌種群。與16S rDNA測序相比，宏基因組學方法的主要優勢在于能夠將微生物組中的細菌表征為“種”水平。此外，宏基因組學還提供了有關整個基因庫、基因組結構和組織、微生物群落結構和樣品中存在的進化關系的全面信息。因此，與16S rDNA標記基因方法相比，宏基因組測序具有明顯的優勢。宏基因組方法的主要挑戰是生成的序列數據量大。與基于16S rDNA的方法相比，這種方法成本較高。此外，數據分析需要一定的生物信息學基礎以及長期的經濟投資，而這只有在專業實驗室才有可能實現。由于目前仍缺乏專門設計的參考數據庫，使得在嘗試常規提取生物學信息時使用該技術具有挑戰性。

1.3宏轉錄組測序 宏轉錄組學(Metatranscriptomics)[11]是特定時期環境樣本、組織樣本中所有的微生物的RNA(轉錄本)的集合。通過對這些轉錄組進行大規模高通量測序，可以直接獲得環境中可培養和不可培養的微生物轉錄組信息。這項技術除了可以區分微生物群落中的活菌群外，還可以對微生物群落中不同的細菌成員進行功能表征。在復雜的微生物樣品中，不同的微生物群落會相互作用，從而降解、破壞或發酵基質的有機成分。對這些樣本中純化的RNA進行測序將提供相關細菌群落如何相互作用的基本描述。然而宏轉錄組學也有一定局限性。首先，很難從環境樣品中獲得高質量和足量的RNA；其次，將目標mRNA與高豐度的RNA類型(例如rRNA)分開是一個挑戰；第三，mRNA的半衰期短導致難以做到對環境變化的快速和短期響應；第四，參考數據庫不足[12]。

2 高通量測序技術在鳥類腸道微生物研究中的應用

2.1揭示鳥類腸道菌群的多樣性 高通量測序技術在鳥類腸道菌群中的應用尚處于起步階段，較早的報道見于2013年對鴯鹋盲腸菌群的多樣性研究[13]。鳥類的消化道由食道、嗉囊、腺胃(前胃)、肌胃(砂囊)、小腸、盲腸、結腸、泄殖腔組成，其核心微生物主要由4個門構成：厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)[14]。與哺乳動物相比，鳥類的胃腸道相對較短，消化過程需要不到3.5小時，這使其形成一個具有很強選擇性和適應性的微生物組。Bodawatta等人[15]利用高通量測序發現了新幾內亞雀形目鳥類消化道微生物菌群的差異。這些差異與鳥類的食性(食蟲或雜食鳥類)有關。相比之下，在野生紅嘴鴉的研究中，口咽、消化道、小腸和大腸4個部位的優勢菌門的相對豐度之間沒有發現明顯的差異。此外，這4個消化道部位中的菌群多樣性和豐富度指數也沒有發現顯著差異[16]。

在脊椎動物中，哺乳動物的飲食和宿主系統發育地位驅動著腸道菌群變化，但這種驅動模式是否適用于所有鳥類尚不清楚。隨著高通量技術的發展，發現了一系列影響鳥類腸道微生物組成和多樣性的因素。例如Dong等人[17]通過16S rDNA的高變區V3～V4測序，對不同地區的白頭鶴腸道菌群多樣性的研究發現在不同的取樣地點和越冬期白頭鶴腸道細菌群落結構和多樣性存在顯著差異，而環境因素可能是影響腸道菌群組成的重要因素。除此之外，Bodawatta等人[15]也發現宿主飲食與宿主系統發育對鳥類腸道菌群均有一定影響，但宿主飲食的影響似乎更大。最近一項研究[18]納入了315種哺乳動物和491種鳥類，分析發現鳥類和能飛行的哺乳動物—蝙蝠的菌群組成相似性高，在不具備飛行能力的哺乳動物中，飲食和短期進化親緣關系驅動著腸道菌群組成變化，但鳥類和飛行類哺乳動物—蝙蝠打破了這種模式，提示飛行的適應性或破壞了宿主和微生物之間長期存在的共進化關系。由此可見，鳥類的物種豐富，生活史特征多種多樣，需要納入更多、更廣泛的個體來評估環境、宿主、飛行等因素對鳥類腸道菌群的影響。

2.2研究抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes，ARGs) 近年來，許多細菌感染變得越來越難以治療，部分原因是由于人類病原體對抗生素的耐藥性增加。最近的研究表明，環境和野生動物都是抗性基因多樣性的主要來源和宿主[19]。鳥類的生態位多樣化且容易接觸到人類和環境中的細菌，成為包括病原體在內的不同細菌物種的帶菌者和傳播者，且可能遠距離傳播含有抗生素抗性基因的病原體[20-21]，這在一定程度上可能導致了耐藥基因在細菌間的擴散和傳播。最近一項研究發現，鳥類腸道菌群中的ARGs類型幾乎對臨床和農業常用的所有主要抗生素類別都具有耐藥性[22]。因此，進行特定系統的整個微生物群對抗生素耐藥性的研究是很重要的。

雖然對鳥類抗生素的大多數研究都是基于體外培養的細菌，但高通量測序技術的發展極大地擴展了我們對環境中耐藥基因庫的認識。整個轉錄組的基因測序(即宏轉錄組)對于抗生素耐藥性基因的研究具有很多優點。因為宏轉錄組可以從整個微生物群落獲得數據，尤其是功能活躍的基因，而非必需的基因往往會丟失[23]。Marcelino等人[24]應用宏轉錄組學對110只鳥類的糞便樣本進行了研究，評估澳大利亞水鳥和南極洲企鵝的腸道微生物組中轉錄的ARGs的多樣性和豐富性。研究發現即使在澳大利亞和南極洲等偏遠地方的鳥類也具有廣泛的抗生素耐藥性，并且與人類廢棄物接觸(即使經過污水處理)似乎會影響禽類野生生物對ARGs的獲取。以高通量測序技術為基礎的宏轉錄組學是一項強大的工具，即使目前相關文庫的數量相對較少，也有可能在不同地區的鳥類之間進行有意義的比較，從而為將來的研究提供指導。

2.3發現鳥類攜帶的病原微生物 鳥類是許多新發傳染病和人獸共患病病原體的宿主，其體內外經常帶有一些病原微生物，包括禽流感病毒、沙門氏菌、彎曲菌、西尼羅病毒等[25-27]。不論是人獸共患病或是動物源性傳染病均為威脅人類健康的重大隱患，威脅著全球公共衛生安全。高通量測序可以幫助快速識別特定樣本中存在的致病菌和病毒，這在一定程度上提高了我們對病原微生物多樣性和進化的了解，并有助于估計對家禽或人類的潛在風險，為病原體的鑒定、人類傳染病的診斷提供幫助[28-29]。

高通量測序在鑒定未知病原微生物方面具有巨大的優勢。孟祥莉等人[30]利用 PacBio RS Ⅱ 三代高通量測序技術獲得近似16S rRNA基因全長序列，分析得到青藏高原禿鷲腸道中已知種的102個OPUs，有45個OPUs為人臨床樣本中分離的病原菌或者引起過人類疾病暴發的病原菌，例如類志賀鄰單胞菌、梭狀芽胞桿菌、產氣莢膜梭菌、溶血葡萄球菌以及泡囊短波單胞菌等，其中致病性產氣莢膜梭菌在禿鷲的腸道菌群中豐度最高，此外還從禿鷲的糞便中分離得到了3株可能具有致病性的放線菌。Truchado等人[31]利用病毒宏基因組學(Virome)首次在一個偏遠地區的野生鳥類種群中檢測到了一種新的Gyrovirus—GyV11，糞—口途徑可能是Gyrovirus的主要傳播途徑，但其在禽類中的致病機理，是否可以感染人或雞，尚需要進一步研究。以上研究均表明高通量測序對闡明病原微生物的結構和起源、理解病原感染可能如何影響鳥類種群的健康以及鳥類作為可能感染其他動物物種病原的潛在來源都十分重要。

此外，高通量測序的發展，促進了病毒學的研究從傳統簡單的單宿主、單病毒發展為多宿主、多病毒的研究，使得探索野生鳥類中決定病毒群落結構的因素成為可能。關于鳥類目Anseriformes和Charadriiforme的研究則很好的證明了這一點。Wille等[32]通過宏轉錄方法描述了隸屬于這兩種鳥類目中9種鳥類的病毒組特征，鑒定出27種病毒，其中有24種是新病毒。在這些樣本中病毒豐度、α多樣性等存在著大規模的異質性以及一定程度的連通性，并且宿主生態學的各個方面，如覓食生態學在塑造病毒組組成方面可能比宿主分類學更為重要。另一項研究[33]中也表明，相較于宿主分類學，感染甲型流感的狀態、地理位置等似乎對鳥類中病毒組的豐度及多樣性的影響更大，即在病毒組結構方面，宿主生態學可能比宿主分類學起到更為重要的作用。

3 結語與展望

基于高通量測序技術的16S rDNA測序、宏基因組學和宏轉錄組學等，給微生物研究帶來了革命性的變化，也推動了鳥類腸道微生物的研究。未來隨著高通量測序的成本進一步降低、生物信息學分析技術提高以及廣泛推廣，其將在鳥類腸道菌群、ARGs以及鳥類相關病原微生物等領域取得更為顯著的成果，對新發傳染病發現及溯源、人畜共患病的防控和ARGs監測等具有重要指導意義。

利益沖突：無