2014-2019年阜陽市食品和病人分離單增李斯特菌的分子特征分析

孟昭倩，段 然，呂東月，郭國俠，郭靚子，卜 戈

單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，Lm)簡稱單增李斯特菌，屬于李斯特菌屬，為革蘭陽性短小桿菌，廣泛分布于自然界，是重要的食源性人獸共患病原菌之一[1]。可引起人和多種動物的胃腸炎、腦膜炎、敗血癥、流產等[2]。該菌環境耐受性較強，溫度要求不高，0 ℃～45 ℃均能生存和繁殖。研究表明，李斯特菌病散發和暴發的重要原因是食入被Lm污染的食品[3]，主要感染者為免疫力低下的人群、孕婦和新生兒[4-5]，據報道新生兒感染該菌死亡率最高達56%[6]。為了解Lm的流行病學特性，本研究對阜陽市2014-2019年從食品和病人樣本中分離的55株Lm進行毒力基因、MLST和PFGE分型分析，以建立Lm分子特征數據庫，為本地單增李斯特菌病的預防控制提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1菌株來源 共55株Lm納入本研究，其中3株病人菌株分別分離自早產孕婦的胎膜(胎死宮內)、早產嬰兒的腦脊液、肝硬化敗血癥病人的血液；52株食品株分離于2014-2019年阜陽市食品安全風險監測樣品，樣品采集按照安徽省食品安全風險監測工作方案要求，采集于本市幾個綜合性超市、農貿市場、餐飲店的生畜肉、熟肉、沙拉和豆制品等。

1.1.2主要試劑和儀器 培養基(北京陸橋技術有限責任公司)、DNA提取試劑(江蘇百世諾醫療科技有限公司)、限制性內切酶AscI(New England Biolabs)、毒力基因和管家基因引物合成于生工生物工程(上海)股份有限公司。全自動微生物鑒定儀VITEK2(法國梅里埃公司)、全自動核酸提取儀(臺灣圓點奈米技術開發有限公司)、凝膠成像及脈沖場凝膠電泳系統(美國Bio-Rad公司)擴增儀、電泳儀(DYY-C6北京市六一儀器廠)。所用培養基和試劑均在有效期內使用。

1.2 方 法

1.2.1菌株復蘇和培養 取-80 ℃磁珠凍存管保存的55株Lm，用Lm顯色培養基復蘇培養。36 ℃培養24 h，菌落為藍色，周圍有白色暈環，鏡檢為革蘭陽性小桿菌，在動力培養基25 ℃培養48 h呈倒傘型，所有菌株均經生化鑒定或全自動微生物鑒定儀VITEK2鑒定確認為Lm。

1.2.2模板制備 將鑒定后的55株Lm接種于腦心浸瓊脂平板，36 ℃培養24 h，取2～3個菌落接種于5 mL LB增菌肉湯，36 ℃ 260 r/min過夜震蕩培養，按照核酸提取試劑盒說明書提取DNA，即為擴增模板。

1.2.3毒力基因檢測 采用PCR方法檢測Lm的6個毒力基因prfA、plcB、hly、actA、iap、inlA。擴增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，30個循環；72 ℃ 10 min。取5 μL擴增產物進行電泳，220 V 20 min。Lm的6個毒力基因的檢測引物[7-9]及產物大小見表1。

表1 單增李斯特菌毒力基因檢測引物序列及產物長度

1.2.4分子分型

1.2.4.1PFGE分型 根據國家致病菌識別網技術規范單增李斯特菌PFGE操作程序，制備55株Lm和沙門菌標準株(H9812)DNA膠塊，用限制性內切酶AscI和XbaⅠ分別對Lm和沙門菌標準株(H9812)DNA膠塊進行酶切37 ℃ 3 h，電泳19 h，初始轉換時間4.0 s，終末轉換時間40.0 s，電泳染色后經凝膠成像系統拍照，轉化為tif格式，再用BioNumerics7.6軟件對獲得的PFGE電泳圖譜進行聚類分析。

1.2.4.2MLST分型 采用abcZ、bglA、cat、dapE、dat、ldh、lhkA共7對管家基因引物進行擴增，擴增條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s(blgA基因退火溫度為45 ℃)，72 ℃ 2 min，25個循環；72 ℃ 10 min。單增李斯特菌7個管家基因引物序列、產物長度見參考文獻[10]、經電泳結果確認后將擴增產物送北京擎科生物科技有限公司進行雙向測序。測序結果用Seqman軟件檢驗與拼接，以Mega軟件截取比對序列，結果與Lm的 MLST 數據庫(http：//www.mlst.net)進行比對獲得管家基因編號及ST型別的唯一序列號。運用 BioNumerics 7.6軟件進行聚類分析。

2 結 果

2.1毒力基因分布 3株病人分離菌株和52株食品分離菌株的6種毒力基因prfA、plcB、hly、actA、iap、inlA全部為陽性。

2.2MLST分型結果 55株Lm共分為14個ST型，其中52株食品株Lm分為13個ST型，包括ST9型(24株)、ST5型(6株)、ST121型(4株)、ST8型(4株)、ST297型(3株)、ST11型(2株)、ST155型(2株)、ST224型(2株)、ST3型(1株)、ST87型(1株)、ST321型(1株)、ST378型(1株)、ST575型(1株)。病人分離的3株Lm分別為ST87型、ST91型和ST224型。ST87型、ST224型為食品和病人菌株共有型別。所有菌株以ST9為優勢型別(24/55，43.64%)，其次為ST5型(6/55，10.91%)、ST121/ST8(4/55，7.27%)，ST224/ST297(3/55，5.45%)(圖1)。優勢的ST9型菌株在2014-2018年均有出現。

Note: Each circle represents a single ST.The diameter of the circle was proportional to the number of strains.The number of different alleles between STs was on the lines between ST.

2.3PFGE分型結果 55株Lm菌經AscI酶切電泳后共分為21個帶型(PT型)，相似度60.3%～100%。其中GX6A16.AH0007(19/55)為優勢PT型，且均為ST9型菌株。圖2的聚類分析顯示，52株食品菌株中存在同一年份分離菌株分屬于不同分支，而不同年份分離菌株有相同型別的現象。2016和2018年食品分離的3株菌均為GX6A16.AH0006型，其中2株為ST9型，1株為ST575型；2017年在同一超市熟食柜、同時采樣的兩種涼拌菜分離的菌株其PT型和ST型均不相同，千張豆腐分離菌株FY2017050為GX6A16.AH0007和ST9型，而涼拌豆餅分離菌株FY2017052為GX6A16.AH0001和ST155型別。3株病人分離菌株的PT型和ST型互不相同；2018年病人腦脊液分離菌株FY2018071和2014年食品分離菌株2014151、2014152的PT型和ST型完全一致，分別為GX6A16.AH0014和ST224型；2019年病人胎膜分離的菌株FY2019026和2014年食品分離菌株2014012的PT型和ST型完全一致，分別為GX6A16.AH0015和ST87型；2019年病人血液分離菌株FY2019039為GX6A16.AH0004和ST91型。

圖2 55株單增李斯特菌PFGE聚類圖、序列型別

3 討 論

Lm是一種重要的食源性致病菌，在生畜肉、熟肉、沙拉等食品中均可檢出。誤食了被該菌污染的食物可引起李斯特菌病，尤其對免疫力低下的患者和圍產期婦女造成的危害更為嚴重。近年來報告的李斯特菌病病例逐漸增多[11-15]。

Lm的致病性與其所攜帶的毒力基因密切相關，目前已發現的毒力基因較多，這6個毒力基因prfA、plcB、hly、actA、iap、inlA功能較為清楚。hly基因編碼的溶血素是 Lm 的重要毒力因子，溶血素與Lm的致病性密切相關；iap基因編碼的 P60蛋白是Lm的重要抗原，與侵襲性有關；prfA是毒力調控基因，可轉錄和調控Lm的多種毒力基因；inlA基因編碼內化素，介導細菌侵入宿主細胞；actA基因編碼肌動蛋白，為細菌運動提供動力；plcB編碼磷脂酰膽堿磷脂酶, 與細菌的擴散能力有關[16-18]。本研究從多類食品特別是熟肉、沙拉、涼拌菜等直接食用的食品中分離到的Lm均具有這6種毒力基因，提示這些食源性Lm對人們健康存在潛在威脅，有出現食源性感染性暴發疫情的可能性，應引起衛生監督部門的高度重視。

PFGE技術因分辨率高、分型能力強、重復性好的特點被譽為細菌性傳染病病原分子分型的“金標準”[9]。通過對電泳條帶的比較分析可以反映出不同菌株的相關性。本次聚類分析結果表現為多樣性，55株Lm分為21個PT型。3株病人分離株為不同的PT型，存在病人菌株和食品菌株型別完全一致情況；52株食品株中相同年份有多種帶型共存，不同年份菌株存在相同的帶型。說明食品銷售環境中具有多種型別的Lm持續存在，有可能隨著地區間食品運輸和銷售鏈進行擴散傳播，因此食品安全需要加強對污染食品的監管。

MLST通過比對Lm 7個管家基因的核苷酸序列多樣性，進而研究菌株間的遺傳相關性和種群結構的一種基因分型方法。本研究中使用MLST將55株Lm分為14個ST型，其中52株食品分離株中優勢菌株為ST9型，其次為ST5、ST121、ST8、ST297、ST224，與馬愛靜，霍哲等的研究結果相似[3,19]。3株病人分離菌株型別各不相同，而有2株病人和食品分離菌株型別相同。2019年分離于早產孕婦胎膜(胎死宮內)的菌株FY2019026和2014年食品分離株2014012的PFGE帶型和MLST型別完全相同，為GX6A16.AH0015和ST87型，ST87型菌株為單增李斯特菌病病例樣本中多見型別[20]；菌株FY2019039分離于肝硬化敗血癥病人的血液，其PFGE帶型和MLST型為GX6A16.AH0004和ST91，暫未發現與其型別相同菌株；菌株FY2018071分離于早產嬰兒的腦脊液，和2014年食品分離菌株FY2014151、FY2014152 的PFGE帶型和MLST型別完全相同，均為GX6A16.AH0014和ST224型，說明Lm的一些型別菌株可持續多年污染本地的食品并具有致病性，對人群具有較高的感染風險。這種食品株和病人株型別相同的現象在國內其他學者的研究中也有報道[20-21]。

由圖2可以看出多數菌株PT型相同ST型相同；有些菌株ST型相同PT型不同，有些菌株PT型相同ST型不同，如FY2016038、FY2018004、FY2018021的PT型相同均為GX6A16.AH0006，而MLST型菌株FY2016038為ST575型、菌株FY2018004和FY2018021為ST9型。PFGE可分析細菌之間的相關性，追溯感染來源，MLST通過分析每個管家基因的核苷酸序列特征，反映菌株間的遺傳相關性、克隆性。對ST型、PT型均一致的食品和病人菌株進行基因組測序分析，可進一步確定是否為相同或相近克隆來源菌株等。同一超市熟食柜、同時采樣的兩種涼拌菜，PT型和ST型均不相同，PT型為GX6A16.AH0007和GX6A16.AH0001，ST型為ST9和ST155。說明該熟食柜同時存在多種型別的Lm污染，并且攜帶毒力基因，說明我市具有食源性李斯特菌病散發和暴發的潛在危險。應加強食源性Lm的病原監測、感染風險評估、食品衛生監管措施等。

本研究采用分子分型技術對阜陽市2014-2019年病人和食品樣本中分離的55株Lm進行分子分型分析，同時檢測其毒力基因，建立了Lm分子特征數據庫，為本市李斯特菌病的預防控制提供了參考依據。

利益沖突：無