牛病毒性腹瀉病毒診斷方法與防治措施

帕力達·阿奴爾別克

（新疆伊犁州尼勒克縣畜牧獸醫工作站 835700）

牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）屬于黃病毒科瘟病毒屬成員，與同屬的豬瘟病毒、羊邊界病毒在血清學上存在交叉反應，BVDV 具有兩種基因型，根據是否存在細胞病變可以分為細胞病變型和非細胞病變型，細胞病變型的致病性較強。BVDV 感染會導致母牛繁殖障礙，給胎牛會造成持續性感染，導致胎牛畸形或死亡，BVDV 除了在臨床感染牛、羊、鹿、駱駝、豬等易感動物外，還可以造成疫苗等生物制品的污染，由于疫苗在生產過程中不可避免的需要使用牛血清等原輔料，如果牛血清等原輔料中存在BVDV，將造成生物安全的隱患，故加強BVDV 診斷與防治研究意義非常重大。為了準確診斷BVDV，除了根據臨床發熱、腹瀉等臨床癥狀進行臨床診斷外，主要以實驗室診斷為主，現將BVDV 的主要實驗室診斷方法和防治措施介紹如下。

1 RT-PCR 檢測方法

RT-PCR 檢測方法是當前動物疫病診斷最常用的分子生物學檢測方法，由于可以檢測到不同致病源的特異性基因片段，故根據BVDV 的保守序列設計通用檢測引物以及根據不同基因型的差異序列設計分型檢測引物，即可實現BVDV 的鑒定和分型研究。李新培等[1]根據GenBank 中公布的BVDV 高度保守的5′UTR 序列分別設計鑒定引物及分型引物，建立了BVDV 的鑒定RT-PCR 檢測方法及分型RT-PCR 檢測方法，鑒定引物對BVDV-1 型和BVDV-2 型均可以擴增出大小為288bp 的特異性片段，分型引物對BVDV-1 型和BVDV-2 型可以分別擴增出大小為316bp 和110bp 的特異性片段，該檢測方法可以用于BVDV 的流行病學調查和臨床病料檢測，具有廣闊的應用前景。

2 熒光定量PCR 檢測方法

熒光定量PCR 檢測方法是在常規PCR 方法中融匯光譜技術發展起來的一種敏感性更高的核酸定量檢測技術，劉存等[2]建立了BVDVSYBR Green 熒光定量PCR 檢測方法，該方法有很好的敏感性和特異性，敏感性達到10 拷貝的最低檢測下限，與牛副流感病毒3 型、牛傳染性鼻氣管炎病毒不存在交叉反應，唯一不足的是不能實現與豬瘟病毒的鑒別診斷。王艷杰等[3]建立了BVDV-1 和BVDV-2 雙重TaqMan 熒光定量PCR鑒別檢測方法，該方法是根據牛病毒性腹瀉病毒5′UTR 區設計鑒別檢測引物和探針，與豬瘟病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒、口蹄疫病毒等沒有交叉反應，該方法對BVDV-1 的最低檢測下限為10 拷貝/μL，對BVDV-2 的最低檢測下限為100 拷貝/μL，可以用于BVDV 的臨床診斷及分型鑒別檢測。

3 LAMP 檢測方法

LAMP 檢測方法為一種環介導等溫擴增技術，是一種新型的核酸等溫擴增技術，具有操作簡單和現場應用方便等優點，可以用于疾病的快速臨床診斷。李家偉等[4]針對BVDV 5′UTR基因序列設計4 條特異性LAMP 檢測引物，通過優化反應時間和反應溫度，建立了BVDV RT-LAMP 快速檢測方法，該方法在63℃等溫條件下50min 即可完成反應，最低可檢測到10-6倍稀釋的BVDV 病毒液，比常規RT-PCR 檢測方法的靈敏度至少高100 倍，與其他病毒沒有交叉反應，具有簡單、快速、靈敏度高、特異性強的優勢，可以用于BVDV 的現場診斷和監測。

4 ELISA 檢測方法

ELISA 方法因具有操作簡單、特異性強、靈敏度高、高通量、易于大規模檢測等優點，在動物疫病臨床診斷和流行病學調查中得到了廣泛應用。胡俊英等[5]利用制備的BVDV 單克隆抗體與多克隆抗體建立了BVDV 抗原的雙抗體夾心ELISA 方法，該方法具有較高的特異性和敏感性，該方法可檢測到160倍稀釋的BVDV 陽性糞便樣品，與牛腸道病毒、口蹄疫病毒、牛細小病毒不發生交叉反應，該方法與常規RT-PCR 方法的符合率達到100%，雙抗體夾心ELISA 方法非常適合于大規模樣品中BVDV 感染的流行病學調查，為BVDV 感染的診斷、檢疫、凈化及防治提供了有效的技術手段。

5 防控措施

BVDV 沒有特效治療藥物，預防本病最有效的方法是疫苗免疫接種，對6～10 月齡的犢牛接種滅活疫苗，牛場要堅持自繁自養，不從疫區引進犢牛，新引進的犢牛可以通過采血監測血清中和抗體，BVDV 抗體陰性方可以混合飼養[6]。由于公牛的精液也可以傳播BVDV，所以注意在配種時也要加強公牛的病毒檢測，確保配種所用的種公牛沒有感染病史，排除帶有牛病毒性腹瀉病毒及隱性感染的牛，減少安全隱患。總之，BVDV 對養牛業危害巨大，是牛群高度易感的重要病毒性傳染病，養殖場要加強疫苗免疫接種和生物安全防控，發現帶毒牛患病牛要及時隔離治療或淘汰，加強飼養場的環境消毒，保證飼料和飲水清潔，定期清理糞便，加強牛舍通風換氣，做好防寒和保暖措施，引種時嚴格隔離檢疫，只有做到BVDV 的積極防控才能降低發病風險，促進養牛業健康發展。

6 結語

BVDV 是一種接觸傳染性疾病，呈全世界分布，嚴重危害畜牧業的健康發展，加強BVDV 實驗室診斷技術和防控措施對BVDV 的有效控制與凈化至關重要。當前，在BVDV 諸多實驗室診斷方法中，RT-PCR 方法操作簡單、檢測快速、只需要簡單的儀器設備，但其檢測靈敏度較熒光定量PCR 方法低。熒光定量PCR 方法的敏感性比常規RT-PCR 方法高，但該方法對試驗人員技術水平、儀器設備要求均較高。LAMP 檢測方法無需儀器設備，操作簡單，該方法對引物設計的要求較高。ELISA方法高通量、操作簡單、適合大批量樣品的流行病學調查。在BVDV 的防控中，應采取以預防為主的綜合防控措施，即加強疫苗免疫接種與生物安全、加強日常的飼養管理措施，盡量避免BVDV 的感染，對于已經感染BVDV 的牛群應逐步淘汰、凈化。