艱難梭菌感染：宿主免疫研究進展

呂 婷， 周芬芬

艱難梭菌（Clostridioides difficile，原為Clostridium difficile）[1]為革蘭陽性專性厭氧菌，艱難梭菌感染（CDI）主要通過糞-口途徑傳播。正常腸道菌群可有效抑制艱難梭菌的繁殖，而抗菌藥物、免疫抑制劑等可破壞腸道菌群平衡[2-3]，使其定植并大量繁殖，并分泌毒素A （TcdA，308 kDa，由2 710個氨基酸組成）和/或毒素B（TcdB，270 kDa，由2 366個氨基酸組成）[4]，產生以腹瀉為主要表現的一系列臨床癥候群[5-6]。艱難梭菌是醫院感染性腹瀉中最常見的病原菌之一。2000年以來，隨著高毒力NAP1/BI/027株的出現和傳播，醫院獲得性CDI（HA-CDI）的發病率增長了2.7倍[2-3]。以北美地區為例，HA-CDI所致的死亡率從＜1.5%增長到4.5%～5.7%，在流行期間可以達到16.7%[7-8]。

人體CDI后，機體啟動固有免疫應答和適應性免疫應答，前者得到了廣泛的研究，包括腸黏膜免疫反應中巨噬細胞的吞噬作用、氧化殺傷作用，以及細胞因子介導的組織損傷和修復作用等；后者一般指T淋巴細胞和B淋巴細胞介導的抗原抗體反應。目前適應性免疫應答研究仍主要關注于艱難梭菌TcdA和TcdB的抗體，包括IgA、IgM和IgG。T淋巴細胞免疫應答的研究并不多。免疫反應與CDI的定植、致病、治療和預后有著密不可分的關系。本文對CDI后機體出現的固有免疫應答和適應性免疫應答作一綜述。

1 固有免疫應答

宿主天然免疫系統在抗CDI過程中發揮著重要的作用。CDI的早期階段主要是通過誘導固有免疫應答。當艱難梭菌進入人體后，腸道內的天然免疫物質發揮即刻的免疫應答，使腸道內的抗菌肽類物質，如防御素、內源性抗菌肽、溶菌酶等發揮抗菌作用[9]。產生的毒素和定植因子也可誘導機體產生天然免疫應答。

1.1 毒素產生的固有免疫應答

TcdA和TcdB主要由4個結構域組成：①N末端的葡萄糖基轉移酶區域（GTD）；②半胱氨酸蛋白酶區域（CPD）；③轉運功能區TD（包含疏水區域）；④肽鏈C端可結合的重復寡肽序列CROP[10]。TcdA和TcdB的GTD結構域可使Rho家族GTP酶（RhoA、Rac1和Cdc42）糖基化，引起肌動蛋白細胞骨架的重新分布和應力纖維的丟失，導致細胞骨架結構改變、細胞變圓、局部粘連解體和緊密連接的丟失[11-12]。TcdA和TcdB引起腸上皮細胞的破壞，使黏膜內免疫細胞暴露，引起免疫反應。

TcdA和TcdB通過激活細胞內的核轉錄因子-κB（NF-κB）、激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）[13]和炎癥小體（inflammasome）[14]三種信號途徑在腸黏膜上皮細胞和固有層內的單核細胞、巨噬細胞、肥大細胞、樹突狀細胞啟動促炎性反應，釋放大量細胞因子，招募以中性粒細胞為主的免疫細胞到炎癥部位，清除細菌[15-17]。有研究發現活性氧（reactive oxygen species，ROS）參與TcdA誘導的大鼠腸炎，后來進一步研究發現TcdA可以引起線粒體膜電位的耗竭和ROS的釋放，線粒體定位和功能障礙出現在細胞變圓之前，提示TcdA對線粒體的損傷可能發生于細胞毒性的早期[18]。Kim 等[19]也發現受到TcdA感染結腸細胞會產生ROS，進而可以激活p38-MAPK信號通路，導致環氧化酶2（COX-2）的生成和前列腺素E2（PGE2）的分泌，從而上調IL-8基因的轉錄。在對腸神經細胞的研究中發現，TcdA誘導產生的ROS可降低細胞活性導致細胞凋亡，并且激活p38-MAPK信號通路刺激細胞因子的產生[20]。TcdB可以直接導致線粒體結合還原性輔酶（NADPH）復合體形成，產生的大量ROS直接促進細胞壞死，這一過程是獨立于毒素的葡糖基酶作用的[21]。另外TcdA和TcdB可以激活機體的P38-MAPK、ERK1/2途徑和接下來的NF-κB途徑產生TNF-α、IL-6、IL-23、IL-1β前體和IL-18前體[22]，TcdA通過激活絲裂原活化蛋白激酶 （mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑進而激活轉錄因子AP-1，上調IL-8基因的轉錄[23]。此外，TcdA和TcdB通過使細胞Rho和Ras家族GTP酶糖基化，可激活胞內感應蛋白吡喃（pyrin）與銜接蛋白ASC、胱天蛋白酶前體（procaspase-1）共同構成的吡喃炎癥小體，激活胱天蛋白酶-1（caspase-1），促進IL-18和IL-1β從前體到成熟。活化的胱天蛋白酶-1可以促進IL-1β、IL-18分泌[24-25]。Xu等[25]的研究發現TcdB激活的吡喃炎癥小體可以激活胱天蛋白酶-1，進而激活消皮素D（gasdermin D），可引起細胞膜損壞，導致細胞焦亡（pyroptosis）。TcdA和TcdB也可誘導細胞凋亡，毒素可順序激活胱天蛋白酶-3、8、9，引起人結腸上皮細胞、單核細胞、成纖維細胞凋亡[17]。目前認為細胞凋亡和焦亡是機體抗艱難梭菌侵襲的胞內防御機制。

1.2 定植因子產生的固有免疫應答

研究表明艱難梭菌可以定植在體外的類結腸上皮細胞Caco-2細胞和黏液分泌HT29細胞，可定植在小鼠盲腸、結腸及人的結腸上皮[26-28]。參與艱難梭菌定植的因素包括細胞壁蛋白（cell-wall proteins， CWP）、鞭毛（flagella）等[26，29]。

在C W P中，研究發現S層蛋白（S-l a y e r proteins，SLP）、黏附素66（adhesin Cwp66）以及Cwp84蛋白酶參與了艱難梭菌定植。SLP的前體蛋白SlpA（S-layer precursor）在Cwp84蛋白酶的作用下裂解成高度保守的高分子量SLP（high-molecular-weight SLP，HMW-SLP，也稱作P47）和菌株之間高度變異的低分子量SLP（low-molecular-weight SLP，LMW-SLP，也稱作P36），而后共同組裝成為SLP[30-32]。SLP可以激活巨噬細胞膜上的TLR4信號通路，釋放IL-6、IL-10、IL-12p40、巨噬細胞炎癥蛋白MIP-1α、MIP-2和單核細胞趨化蛋白（MCP）[33]。HMW-SLP可特異性錨定在人腸黏膜上皮細胞的細胞壁上，而LMW-SLP作為菌體最外層的部分，其高度的序列變異性提示其可能與宿主的免疫反應有關。Lynch等[33]對不同SLP序列的菌株對宿主反應的影響進行了研究，發現含有高度slpA基因變異序列的核糖體核型（ribotype，RT） 027和RT078菌株比RT001和RT014菌株引起更強烈的免疫反應，不僅細胞因子表達升高而且巨噬細胞上的CD40、CD80和MHCⅡ表達也升高。

鞭毛也可介導艱難梭菌對黏膜細胞的黏附并參與黏膜免疫反應。艱難梭菌鞭毛通過激活模式識別受體TLR5，激活NF-κB和MAPK信號途徑，促進IL-1β、IL-6、IL-8、IL-22、TNF-α等細胞因子的產生[34-35]。另有研究利用動物實驗發現鞭毛和毒素引起的黏膜炎性反應相互協同，鞭毛的敲除會降低小鼠炎性反應的程度[36]。

1.3 固有免疫反應的雙重作用

艱難梭菌可通過多種機制刺激機體釋放大量促炎因子和趨化因子，招募大量免疫細胞到感染部位，通過以中性粒細胞為主的免疫細胞的吞噬作用，釋放抗菌肽、活性氮、ROS清除病原菌[18，37]，同時又產生炎癥相關的組織損傷。

CDI可以引起全身細胞因子的級聯產生，有些細胞因子對機體起保護作用。研究表明IL-27與IL-27受體結合對CDI小鼠有保護作用[38]。轉化生長因子β/核轉錄因子（TGF-β/SMAD）信號通路保護小鼠免受TcdA導致的損傷[39]。IL-22為雙向性細胞因子，在不同組織、不同疾病狀態下例如肺、皮膚表現出復雜的生理作用，以肺組織為例，IL- 22在炎癥狀態下可以促進促炎因子的表達，但在腸道中IL-22表現出對機體的保護作用[40]。體外給予IL-22對CDI小鼠有保護作用。且發現與年輕小鼠相比，老年小鼠存在中性粒細胞的募集障礙，使體內較少表達IL-22，CDI疾病更嚴重[41]。IL-22與IL-22受體的結合在動物實驗中也被證明對小鼠具有保護作用，其發揮作用的機制包括促進上皮組織的再生，下調促炎因子的表達，促進腸道抗菌肽的分泌[42]，并且可以活化肺和肝臟的補體系統，清除易位的細菌等[43]。有研究發現CDI患者和CDI小鼠體內IL-25的表達受到抑制。給予外源性IL-25可以降低CDI相關性死亡率和減輕組織損傷，這一作用是通過腸道嗜酸性細胞介導的[44]。另有研究認為高水平表達的IL-5和 IFN-γ與輕度臨床表現和良好預后相關[45]。

某些細胞因子可以介導CDI的致病過程，加重腸道組織的損傷，例如IL-1β、IL-6、IL-8、IL- 16、IL-17A[45-46]、IL-23[47]、巨噬細胞遷移抑制因子（MIF）和趨化因子CXCL13[48-49]。Huang等[50]發現TcdA和TcdB均可誘導產生血管內皮生長因子（VEGF-A）作用于人腸道微血管上皮細胞，增加結腸血管通透性，有利于TcdA和TcdB的全身性傳播。艱難梭菌導致的腹瀉患者血清中MIF的水平明顯高于非艱難梭菌相關性腹瀉患者。同樣在小鼠模型中，CDI可增加血清中MIF水平，且清除體內MIF后可明顯減輕艱難梭菌誘導的炎性反應和臨床表現，降低死亡率。CXCL5 和IL-8 水平增高也可減緩CDI患者病情的康復。此外，IL-8 表達增多與CDI 復發增加相關，再次證明過度的免疫反應會加重CDI病情[51-52]。有研究報道血清IL-2和IL-15的高表達與重癥CDI和不良預后有關。

2 適應性免疫應答

產毒艱難梭菌在腸道定植后，患者可出現無癥狀攜帶狀態。多項研究認為可能與宿主啟動針對TcdA和TcdB的體液免疫應答有關。Mulligan等[53]發現無癥狀攜帶者血清中的抗體濃度明顯高于有癥狀的CDI患者，尤其是IgA和 IgM。另一研究也證實無CDI癥狀的住院患者血清中有更高水平的抗TcdA IgG抗體[54]。但也有研究結果與之相反。Johnson等[55]發現CDI患者血清中的抗TcdA IgG抗體更高。適應性免疫應答似乎直接決定艱難梭菌定植后疾病的走向。

2.1 體液免疫

在對CDI患者血清的檢測中可以發現抗TcdA和抗TcdB的IgA、IgG和IgM類抗體[56-57]，糞便中可以檢測抗TcdA和抗TcdB IgA類抗體。Viscidi等[58]報道在64%患者血清中檢測出抗TcdA抗體，66%患者血清中檢測出抗TcdB抗體。但多數研究報道抗艱難梭菌毒素抗體的檢出率并不高。Bacon等[59]檢測了185份血清，IgG-α TcdA陽性率為19.4%，IgG-α TcdB檢測陽性率為8.1%。另有研究對健康獻血者的400份血漿樣本的調查中發現抗TcdA或抗TcdB抗體的陽性率為6%[60]。研究認為黏膜免疫反應針對的是腸毒素TcdA，產生IgA-α TcdA應答。一旦細胞毒素TcdB入血，則可產生全身性IgG-α TcdB免疫應答[60]。目前認為高親和力的IgA和IgG可以中和毒素，介導對機體的保護[56]，但抗體效價與毒素中和能力并不呈正相關[60]，而IgM通常產生于免疫應答早期，對毒素有著較低的親和力[61]。血清中抗TcdA和抗TcdB抗體與CDI的復發有關。抗毒素抗體水平越低，越容易復發[62]。Kyne等[63]發現患者初次感染艱難梭菌后，血清中的抗TcdA IgG抗體可減輕復發性CDI的臨床癥狀。

目前多項研究證實針對TcdB的特異性人源性單克隆抗體bezlotoxumab（BEZ）對高危患者復發性CDI預防可取得良好效果[64-65]。bezlotoxumab和actoxumab已經完成三期臨床試驗MODIFYⅠ和MODIFYⅡ，結果顯示單獨應用bezlotoxumab可以降低CDI的復發率，單獨應用actoxumab時復發性CDI的發生率與安慰劑組并無差異，而聯合應用bezlotoxumab和actoxumab可以顯著降低復發性CDI的發生率[66]，美國食品藥品監督管理局（FDA）于2016年正式通過bezlotoxumab的上市要求，主要用于18歲及以上的患者，發生復發性CDI的高危人群，可降低復發性CDI發生率[67]。

在CDI患者血清中也檢測到了針對定植因子的抗體，包括SLP的IgG抗體，Cwp66、蛋白酶Cwp84以及鞭毛蛋白FliC和FliD的抗體[68]。研究發現CDI患者血清中的SlpA抗體高于正常人群。動物實驗證實給小鼠和倉鼠直腸注射純化蛋白SlpA可引起全身性和局部性體液免疫反應，產生IgG和IgA抗體，能減少艱難梭菌在小鼠腸道中定植，并在致死性倉鼠模型中具有部分保護作用[69]。且有研究報道初發艱難梭菌感染患者血清中的抗SlpA IgG抗體水平顯著高于復發患者[70]。Cwp66的錨定區N末端和高度可變區C末端均具有免疫原性，Péchiné等[68]在對CDI患者和健康人的血清中均檢測到了Cwp66兩端的抗體，但C端抗體效價明顯高于N端，提示C末端具有更強的免疫原性。也有研究以灌胃、直腸給藥、皮下注射Cwp84免疫倉鼠，在倉鼠血清中檢測出抗體，并且直腸免疫Cwp84組的艱難梭菌的腸道定植率相比未免疫組降低了26%，倉鼠存活率為33%高于未免疫組[71]。另有研究發現用鞭毛蛋白FliC免疫小鼠可顯著降低艱難梭菌的定植，對CDI小鼠的保護可以達到80%[72]。

2.2 細胞免疫

迄今為止，關于CDI的大多數研究還僅局限于抗體和B細胞的研究，對于T細胞在CDI中的作用還知之甚少，但是在對免疫功能受損患者CDI流行病學調查中發現T細胞免疫缺陷患者（HIV感染、實體器官移植后）CDI的發病率和復發率遠高于正常人群，以肺移植為例，CDI發病率可高達23%，CDI的復發率在以肺移植為代表的實體器官移植中可高達40%[73]。

T細胞免疫應答與機體的固有免疫應答是互相聯系、相互作用的。目前關于適應性免疫應答小鼠方面的研究認為T細胞可以輔助機體B細胞免疫應答和固有免疫應答，CD4+T細胞向B細胞活化提供信號，幫助抗體類別轉換、親和力提高和記憶細胞的形成，驗證了抗毒素抗體的產生需要T細胞的輔助[74]。在對固有免疫應答研究中發現，CDI中高表達的IL-1β可作為Th17的分化因子，介導強有力的Th17免疫應答，分泌IL-17作用于CDI的發病過程中[75-76]。有研究報道將Th17細胞接種至小鼠體內，IL-17水平升高，導致艱難梭菌相關性死亡率增加。Th17細胞軸分泌的細胞因子IL-6和IL-23與疾病的嚴重程度有關。人體感染艱難梭菌后，血清中IL-6水平越高，患者的死亡率越高。因此認為Th17細胞在CDI的致病機制中起著重要的作用。也成為一個潛在的治療靶點[77]。IFN-γ作為Th1的分化因子，介導的Th1型免疫應答可以保護機體，當Th1型免疫應答向Th2或者是Th17轉變時，提示CDI疾病程度加重[45]。從目前的研究報道來看，T細胞免疫也同樣存在雙重作用。

3 結語

固有免疫應答和體液免疫、細胞免疫彼此相互連接，構成復雜的防御網絡應對CDI。本文討論了艱難梭菌感染宿主后所引起的免疫反應，可以看出目前對CDI的認知不僅僅關注艱難梭菌本身，更應關注艱難梭菌與宿主的相互作用，宿主免疫反應的強弱影響著患者的病情嚴重程度和預后。對于艱難梭菌與宿主之間相互作用的研究將為新治療方法和預防措施的研發提供理論基礎和研究方向。