基于鐵死亡Xc-/GPX4通路探究夾脊電針促進脊髓損傷修復機制*

李 全，欒逸先，朱薈一，尹洪娜

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

脊髓損傷(Spinal Cord Injury，SCI)是由于外傷、疾病或先天性因素，導致神經損傷平面以下的感覺和運動功能部分或全部障礙。其高發人群多為青壯年(平均年齡40.7歲)[1]。SCI后由于短期內需要高水準的急癥護理和長期需要治療相關繼發性并發癥，所以需要大量的醫療保健資源，給患者和他們的家庭及社區帶來沉重的經濟負擔。在全球，SCI的男性比例高于女性，但是不同國家的男女比例差別很大，發病高峰年齡為15～30歲,患病率在過去幾十年來一直呈上升趨勢。

脊髓損傷癥狀表現可歸屬于中醫學的“痿證”范疇,又有醫家稱之為“體惰”[2]。臨床可根據脊髓損傷的癥狀表現和中醫學的“痿證”辨證施治，《針灸甲乙經·卷之十》首次提出“治痿獨取陽明”“各補其營而通其腧，調其虛實，和其逆順”的治療原則[3]，這一原則對于脊髓損傷的治療影響至今。《針灸資生經·第五》也指出治療下肢痿躄、麻木不仁多用陽經穴位,記載：“陽輔、陽交、陽陵泉主髀樞膝骨痹不仁……陽關、環跳、承筋主脛痹不仁……腰俞、風府主足不仁，膀胱俞、太溪、次髎主足痙不仁，陽關主脛痹不仁……白環俞療手足不仁……廢其腎則足不能行，當灸腎俞”[4]。總結歷代醫家的學術思想，痿證的病因病機主要由火熱、濕熱、痰濕、氣虛、血虛、瘀血及情志失調等致病因素導致五臟受損、經絡不通，以虛證為主，虛實夾雜者亦不少見。例如急性脊髓炎之癥狀表現多由于肺熱襲肺、先實后虛、虛實夾雜所致。脊髓空洞癥之癥狀表現的病機往往為肝腎虧虛。而外傷性脊髓損傷由不內外因導致，例如墜墮、撞擊、跌仆、閃挫及負重等，導致瘀血或出血過多，瘀血導致督脈受阻、脈道不通或失血元氣大傷、氣血衰弱無以濡養四末，同時五臟陽氣供養不足，體虛外邪侵入，一損俱損，五臟失衡，腎精耗傷，腎主骨生髓，髓不得滋養，腎又開竅于二陰且主生殖，所以可以出現二便失常、性功能障礙的臨床表現。由此可見外傷性脊髓損傷需首辨虛實再加以施治。根據中醫理論和歷代醫家總結，針刺足陽明與督脈穴位可以有效的治療痿證，臨床中常選用內關、足三里、委中及三陰交等穴治療本病。隨著針灸研究的深入，歷代醫家發現針刺損傷節段夾脊穴對于治療本病療效顯著，夾脊針刺方法便廣泛應用于臨床。

隨著現代醫學的發展，結合現代研究發現電場對于脊髓損傷的恢復具有明顯的療效。臨床應用發現將傳統針刺療法與電場結合治療一些疾病能起到極好的治療效果，從此夾脊電針的應用成為了目前中醫治療SCI的首選療法[5]。隨著現代分子生物學的科學技術發展，現代研究表明夾脊電針改善脊髓損傷運動功能恢復機制目前包括抑制細胞凋亡[6]、改善微環境[5]、促進神經再生和抑制炎癥反應[7]等。近幾年研究重點在于夾脊電針通過抑制細胞死亡促進脊髓損傷恢復，其機制包括細胞的自噬、焦亡及凋亡等方面。最新研究表明，一種新的細胞死亡方式——鐵死亡與已知的細胞死亡方式有著密切的聯系，并且發現夾脊電針可以通過此機制促進脊髓損傷的修復，本研究重在論述夾脊電針通過鐵死亡Xc-/GPX4通路促進SCI恢復的相關機制。

1 脊髓損傷后細胞死亡的傳統機制

脊髓損傷后的病理生理過程一般可以分為原發性損傷和繼發性損傷：原發性損傷是指脊髓遭受到的機械性或物理傷害，其后果是不可逆的；繼發性損傷是指發生于脊髓原發性創傷后的一系列病理生理以及生化的改變，包括出血水腫、局部缺血再灌注、炎癥反應、Ca2+溢出、活性氧自由基損傷、興奮性氨基酸的毒性作用、電解質失衡及神經細胞死亡等，使最初病灶周圍完整的組織發生自身破壞性病變[8-10]進一步加深損傷程度并擴大損傷范圍，而脊髓損傷修復的關鍵集中在如何有效抑制繼發損傷造成的一系列破壞。細胞死亡是各種物理和化學因素作用的結果，包括程序性細胞死亡和非程序性細胞死亡。其中非程序性細胞死亡被認為是“偶然”因素導致的死亡，是物理和化學因素直接作用的結果，無法進行調控。因此，控制細胞的程序性死亡就成為恢復脊髓損傷的關鍵。

2 細胞程序性死亡新發現——鐵死亡及Xc-/GPX4通路

目前研究認為程序性細胞死亡(Programmed cell death,PCD)之細胞凋亡、細胞自噬、細胞壞死以及鐵死亡均參與了包括SCI在內的多種神經系統疾病的病理生理過程[11]。在繼往的細胞死亡研究中發現壞死細胞內出現鐵離子(Fe3+)濃度升高現象，但未能對此現象給予明確的解釋。2012年Cell雜志報道了一種新的程序性死亡機制，是鐵離子和脂質活性氧(Reactive oxygen species,ROS)依賴的一種非凋亡程序性死亡途徑，被命名為鐵死亡(Ferroptosis)[12]，并在2017年Cell雜志上詳細敘述了對其作用機制的研究[13]。其形態學特點是胞膜完整、沒有起泡、無破裂；細胞聚集在一起，線粒體濃縮，線粒體膜增厚，線粒體減小或者消失，同時線粒體外膜破裂，細胞核正常，無染色體凝聚。科學研究表明Xcˉ/GPX4通路是其主要的發生途徑之一[14]。同時過量的鐵離子聚集會導致鐵死亡的發生，芬騰(Fenton)反應會生成活性氧，循環鐵以Fe3+依附在轉鐵蛋白的形式存在，Fe3+通過膜上的蛋白轉鐵蛋白受體1(TFR1)進入細胞，然后定位于細胞內。在核內體中，鐵還原酶將Fe3+還原為亞鐵離子(Fe2+)。最后,二價金屬轉運體1(DMT1，也稱為SLC11A2)介導鐵離子從核內體釋放到不穩定的細胞質鐵池中，多余的鐵儲存在鐵蛋白中即含鐵蛋白輕鏈鐵蛋白復合物(FTL)和鐵蛋白重鏈1(FTH1)。鐵離子的出膜是由膜蛋白鐵(也叫鐵射流泵,也稱為SLC11A3)激動的，其能將Fe2+氧化成Fe3+，細胞內鐵離子的失衡導致了鐵死亡的發生。同時鐵死亡的發生取決于ROS是否過載，其將鐵死亡發生過程分成上游(ROS產生)和下游(執行鐵死亡)兩個部分，ROS位于鐵代謝途徑、Xc-/GPX4通路和脂質代謝途徑的交叉處，也受其他通路的共同調控。胱氨酸/谷氨酸逆向轉運體Xcˉ系統是由機體細胞膜上SLC7A11和SLC3A2兩個亞基組成的重要抗氧化體系，可按1:1比例將細胞外胱氨酸攝取入胞內，并被迅速還原成半胱氨酸，參與胞內重要自由基清除劑還原性谷胱甘肽(GSH)的合成。GSH是由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸合成的細胞必要的氧化劑，由谷氨酸-半胱氨酸連接酶(Glutamate-cysteine ligase,GCL)和谷胱甘肽合成酶(Glutathione synthetase,GSS)催化。谷胱甘肽過氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)[15]將胞內GSH轉化為氧化型谷胱甘肽(GSSG)，同時將細胞內毒性脂質過氧化氫(L-OOH)轉化為無毒脂醇(L-OH)[16]。GSH是身體主要的神經遞質和內源性抗氧化劑，當其含量上升時會導致帶有毒性的神經興奮作用。當其調節系統失調時就無法抑制細胞對胱氨酸的攝取，細胞外的谷氨酸含量上升，細胞內的GSH減少從而誘發細胞發生鐵死亡。同時細胞外System Xc-會產生氧化性谷氨酸毒性，可以加速細胞內GSH的消耗，從而導致細胞內過氧化物積累而引起細胞死亡。

胱氨酸在System Xc-的作用下進入細胞內反應生成半胱氨酸，與此同時細胞內的谷氨酸鹽在System Xc-的作用下出細胞生成胱氨酸以維持細胞內外胱氨酸含量的平衡。半胱氨酸和谷氨酸鹽在谷氨酸-半胱氨酸連接酶的作用下以甘氨酸和谷胱肽合成酶為原料反應生成GSH，在細胞內GSH在GPX4的作用下被氧化成氧化型谷胱甘肽(GSSG)，同時在此反應過程中GPX4也同時作用在具有毒性的PL-PUFA-OOH與無毒的PL-PUFA-OH的氧化還原反應中而影響細胞鐵死亡的發生。谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)[17]是erastin和RSL3誘導的鐵死亡的中心調節因子，其調控的鐵死亡是一個共同的機制，有多個獨立的小分子支架。所有的鰭狀化合物都可以根據GPX4抑制模式分為兩類。第一類，包括erastin，通過消耗GSH抑制GPX4;第二類,如RSL3[18]，直接抑制GPX4而不耗盡GSH。

3 脊髓損傷后鐵死亡與氧化應激、自噬、炎癥反應的聯系

在鐵死亡中可以通過Xc-/GPX4通路中關鍵物質GSS、GCL、GPX4等調控細胞中GSH含量來抑制ROS從而抑制鐵死亡的發生。這與機體抗氧化應激反應過程中機體減少體內高活性分子如ROS和活性氮自由基,(Reactive nitrogen species，RNS)的機理相同，通過提升GSH含量清除過多的活性氧自由基和活性氮自由基，保護了細胞和組織免受氧化應激的損傷[19]。同時脂質產物可以從谷氨酰胺轉化成酮戊二酸。這一過程可以被小分子轉氨酶抑制劑所阻斷，活性氧可與脂質膜上的多不飽和脂肪酸(PUFAs)發生反應并誘導脂質過氧化，兩個脂質代謝相關基因(溶磷脂酰膽堿酰基轉移酶)3 (LPCAT3)和酰基輔酶a合成長鏈4 (ACSL4)已被確定促進生成RSL3和DPI7(也稱為ML162)[20]。鐵死亡的發生一定伴隨著GPX4的失活，而GPX4的失活源于花生四烯酸(AA)和其他PUFAs的消耗。研究表明Nrf2是調控細胞氧化應激反應的重要轉錄因子，同時也是維持細胞內氧化還原穩態的中樞調節者。Nrf2通過誘導調控一系列抗氧化蛋白的組成型和誘導型表達，可以減輕活性氧和親電體引起的細胞損傷，使細胞處于穩定狀態，維持機體氧化還原動態平衡。正常生理情況下，Nrf2被Keap1鎖定在細胞質中，當ROS發生時，Nrf2從Keap1中解離并進入細胞核中，先與小Maf蛋白形成異二聚體，再結合抗氧化反應元件(ARE)，轉錄激活受Nrf2調控的抗氧化酶基因表達[21-22]。Nrf2可以通過調控GSH生物合成的限速酶——γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的生成而控制GSH的合成[23]。Nrf2還可以通過控制谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)表達調節GSH的再生，其在過氧化物的解毒過程中利用GSH作為輔因子，將其氧化成GSSG。隨后，Nrf2調控的另一種抗氧化酶——谷胱甘肽還原酶(GSR)又利用NADPH作為輔因子，將上述GPX作用產生的GSSG還原再生為GSH[24]。所以Nrf2可以通過其表達影響ROS、GPX和GSH來調控鐵死亡的發生,這正是細胞通過控制氧化應激反應抑制鐵死亡的途徑。因此，氧化應激反應與脊髓損傷后神經細胞鐵死亡的發生密切相關。

自噬是一種受調控的分解代謝溶酶體依賴過程，它促進細胞消除受損或非功能性細胞成分(線粒體、內質網、過氧化物酶體)、錯誤折疊的蛋白質和病原體，以維持細胞的穩態[25-27]。細胞自噬中溶酶體的重要轉運物質核受體輔活化子4(NCOA4)可以通過與鐵蛋白結合來調節細胞內鐵穩態來調節鐵死亡的發生，同時還可以促進自噬的降解作用[28],實驗表明NCOA4介導鐵蛋白轉運到溶酶體降解[29]，NCOA4的缺失可以通過抑制鐵蛋白向溶酶體的傳遞而抑制鐵蛋白的降解。鐵蛋白轉換的減少導致生物細胞內可利用的鐵顯著減少，改變了細胞內蛋白質的鐵穩態[30]從而導致了鐵死亡的發生。研究表明SCI后，p53、Beclin-1參與了AMPK/mTOR通路介導PI3K調節自噬，同時，p53[31]和Beclin-1[32]可以作用于Xc-系統中的SLC7A11蛋白上，通過調控細胞內外胱氨酸含量影響其穩態導致鐵死亡的發生。因此，自噬與脊髓損傷后的鐵死亡發生也密切相關。

脊髓損傷后，損傷局部嚴重的炎癥反應是大量繼發性損傷重要機制之一。在損傷局部微環境中，免疫細胞、促炎因子、趨化因子等都被證實發生廣泛的變化。在最新研究中發現，炎癥小體過度活化在脊髓損傷局部微環境變化中占據了重要的地位，可能是研究脊髓繼發性損傷機制重要靶點之一。研究表明，SCI后運用藥物抑制NLRP3炎癥小體可以改善SCI后的神經恢復，證明NLRP3炎性小體是導致SCI模型繼發性損傷的重要因素之一[31]。目前發現，在鐵死亡中HMGB1的釋放是一個普遍現象[32],其可以誘導正常的NLRP3、ASC、caspase-1和非正常capase-8-ASC炎癥小體的升高，促進IL-1β的加工[33]。而HMGB1是氧化或還原態決定了HMGB1的功能特征，二硫態(DS-HMGB1)具有促炎功能。研究表明DS-HMGB1增加了離體小膠質細胞中NF-JBIA和NLRP3的表達，增強了小膠質細胞對脂多糖的促炎反應[34]。同時DS-HMGB1直接增強了小膠質細胞的免疫應答。研究證實鐵死亡激活劑可誘導HMGB1的釋放，通過ELISA分析發現鐵死亡的發生增加了HMGB1的釋放量。研究顯示脂質運載蛋白-2(NGLA)通過HMGB1調控TLR4信號誘導NLRP3炎癥激活，脂質運載蛋白-2通過增加IL-1β、IL-18和caspase-1的激活來增強NLRP3炎癥小體的啟動和激活。

4 夾脊電針與鐵死亡

夾脊電針是通過現代醫學研究手段，運用電場結合傳統針刺療法治療相關疾病的一種治療方法。在傳統夾脊針刺治療方法中引入電場，在臨床治療中取得了突出的療效。既往對于夾脊電針治療SCI的機制研究已經證實夾脊電針可以通過抑制細胞自噬、焦亡、凋亡和炎性反應等相關通路達到促進脊髓損傷修復的作用。研究顯示夾脊電針可以升高細胞內LC3-Ⅱ的含量，同時降低P62蛋白含量，增加受損組織自噬流的發生，抑制神經細胞的凋亡；夾脊電針能有效降低NLRP3的表達，改善受損區炎性反應與環境，促進大鼠SCI恢復；夾脊電針可以通過抑制內質網應激因子Caspase-12與CHOP的表達，從而抑制脊髓神經細胞的凋亡。

已有研究發現，鐵死亡是繼發性SCI神經細胞死亡的主要機制，能夠通過SRS 16-86抑制鐵死亡Xc-/GPX4通路促進SCI的修復[35]。還有研究表明游離鐵介導的脂質過氧化反應通常是脊髓繼發性損傷所導致嚴重后果的重要原因之一。并證實在脊髓神經元的培養液中加入亞鐵離子，發現神經元的脂質過氧化產物產生量與神經元失活呈正相關，并且脂質過氧化代謝產物同細胞內鐵離子的水平具有明顯的相關性。在脊髓損傷的動物模型中發現羥基鐵離子可能是繼發性脊髓損傷的一個重要原因，具有非常重要的作用，脊髓損傷后鐵離子含量與脊髓的損傷程度呈正相關。實驗表明，夾脊電針可以激活繼發性SCI的Nrf2活性，通過Nrf2/ARE通路增加GSH的表達量降低過氧化反應，發揮抗氧化作用，促進脊髓損傷修復。而在鐵死亡中GSH正是Xc-/GPX4通路中重要的抗氧化物質，可以上調GPX4的活性抑制鐵死亡的發生；同時夾脊電針可以通過上調Beclin-1含量激發細胞自噬促進SCI的修復，而Beclin-1可以與鐵死亡Xc-系統核心組分SLC7A11結合影響鐵死亡，NCOA4與鐵自噬蛋白的研究也將自噬和鐵死亡緊密的聯系在一起；同時夾脊電針可以通過抑制NLRP3炎癥小體活化促進脊髓損傷修復，研究表明鐵死亡可以控制HMGB1釋放并上調NLRP3炎癥小體活化，并且此過程伴有細胞自噬的參與。因此夾脊電針促進脊髓損傷修復與鐵死亡Xc-/GPX4通路密切相關。然而，關于夾脊電針對于鐵死亡的作用機制、氧化應激反應、自噬和鐵死亡的關系、鐵死亡影響炎性反應從而促進神經細胞再生的詳細機制都仍待探索。

5 總結

近年來，對于脊髓損傷后脊髓和神經細胞的死亡方式以及相關的信號通路的研究已經取得了一些進展，對一些特殊靶點干預從而治療脊髓損傷也取得一些成果，但夾脊電針促進脊髓損傷恢復的作用機制尚未完全明確，而鐵死亡的發現對于脊髓損傷后神經細胞死亡的研究提供了新的思路。夾脊電針是臨床中治療脊髓損傷的常用手段，并且療效顯著，具有極好的臨床治愈率。在既往研究中，通過對于夾脊電針作用于氧化應激反應、自噬、炎癥反應的研究已對其機制有了大致的了解。但是研究結果大多孤立存在，而人體是一個有機的整體，各部分相互協調作用維持機體的正常。鐵死亡的出現給研究夾脊電針促進脊髓損傷修復的機制提供了新的思路，也為將脊髓損傷中的氧化應激反應、自噬、炎癥反應聯系在一起提供了理論基礎。因此，鐵死亡的發現以及其發生途徑中，多種基因的表達和蛋白質的生成與其他死亡方式產生交集的這些現象，為進一步解決上述問題提供了依據，也為發現新的干預靶點、促進脊髓損傷修復提供了新的方向。