復(fù)方丹參滴丸改善心肌缺血再灌注損傷研究進(jìn)展

梁茜 李煒杰 楊希立 王蔚 田平閣

心肌缺血是心肌細(xì)胞氧供需失衡的結(jié)果。盡早進(jìn)行血運(yùn)重建是減少心肌缺血后損傷最有效的方法,但是會伴隨出現(xiàn)心肌缺血/再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury,I/R 損傷)。I/R 損傷通過鈣超載、細(xì)胞凋亡、線粒體損傷、氧自由基生成增加、自噬等機(jī)制發(fā)揮作用［1］。其中,越多越多的研究表明自噬在I/R 損傷和恢復(fù)中起著重要的作用。復(fù)方丹參滴丸為現(xiàn)代中藥制劑,具有理氣止痛、活血化瘀功效。近年來關(guān)于丹參滴丸抗I/R 損傷的研究逐漸增多,是首個通過美國食品藥品管理局(FDA)Ⅲ期臨床試驗(yàn)的中成藥。其作用機(jī)制也日益受到國內(nèi)外研究人員的關(guān)注。本文主要通過回顧I/R 損傷的機(jī)制以及復(fù)方丹參滴丸在冠心病尤其是I/R損傷治療中的分子機(jī)制調(diào)節(jié)作用做文獻(xiàn)綜述。

1 I/R 損傷影響以及機(jī)制

1.1 I/R 損傷的影響 I/R 損傷主要體現(xiàn)為以下4 種臨床表現(xiàn)。①再灌注性心律失常,多發(fā)生在再灌注開始時,常出現(xiàn)加速性室性自主心律、實(shí)行心動過速、室顫等現(xiàn)象,但多為一過性的。②心肌頓抑,心肌恢復(fù)灌注后處于可逆性心肌收縮功能失調(diào),持續(xù)數(shù)小時、數(shù)天甚至數(shù)周。③血液無復(fù)流,缺血心肌在冠脈閉塞或狹窄解除后仍未能恢復(fù)有效再灌注,微循環(huán)血流仍未完全恢復(fù)正常的現(xiàn)象。Eeckhout 等［2］根據(jù)無復(fù)流的特征將其分為3 類：①實(shí)驗(yàn)性無復(fù)流；②心肌梗死再灌注無復(fù)流；③血管造影無復(fù)流：常規(guī)經(jīng)皮冠狀動脈介入(percutaneouscoronary intervention,PCI)過程中產(chǎn)生的無復(fù)流;④微循環(huán)障礙,I/R 會引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)進(jìn)、破壞血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)進(jìn)而阻礙了微血管內(nèi)血液循環(huán)。同時,I/R 極易引起微動脈粥樣斑塊破裂、形成微血栓,進(jìn)一步加重心肌缺血［3］。

1.2 I/R 損傷的機(jī)制 I/R 的發(fā)生機(jī)制主要有以下幾點(diǎn)。

1.2.1 產(chǎn)生過多的氧自由基(OFR) OFR 是機(jī)體內(nèi)氧分子還原的中間產(chǎn)物。生理狀態(tài)下,OFR 可被過氧化氫酶、超氧化物歧化酶(SOD)多種酶清除,減少其對細(xì)胞的損傷。當(dāng)心肌發(fā)生I/R 時,OFR 氧化心肌細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸,生成脂質(zhì)過氧化物(LPO)。生物膜脂質(zhì)過氧化后,可引起細(xì)胞膜功能和結(jié)構(gòu)的障礙、膜磷脂成分改變、通透性增加,最終造成心肌細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)的損傷。

1.2.2 鈣超載 在心肌缺血缺氧的過程中,細(xì)胞內(nèi)的糖酵解逐漸增強(qiáng),引起乳酸堆積,最后導(dǎo)致心肌細(xì)胞酸中毒。恢復(fù)心肌血運(yùn)重建后,乳酸等代謝產(chǎn)物隨血液流走,細(xì)胞外pH 值升高,使細(xì)胞膜上Na-H 離子交換增加,而Na+濃度升高激活Na-Ca 離子交換,使心肌細(xì)胞鈣離子超載,引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的損傷［3］。在心肌I/R 過程中,鈣超載和OFR 過度生成相互促進(jìn),形成惡性循環(huán),加重心肌損傷。同時引起心肌細(xì)胞膜電位異常,誘發(fā)惡性心律失常等。

1.2.3 心肌細(xì)胞凋亡 I/R 后,由于細(xì)胞內(nèi)OFR 增多和Ca2+超載,細(xì)胞核內(nèi)凋亡基因Bcl-2/bax、抑癌基因P53、Bcl-xL、Fas/Fas-L、腫瘤壞死因子高表達(dá),心肌細(xì)胞會啟動凋亡程序。劉艷霞等［4］通過建立心肌缺血再灌注大鼠模型,應(yīng)用缺口末端標(biāo)記法檢測心肌細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果顯示,缺血再灌注組的細(xì)胞凋亡率顯著升高,同時凋亡調(diào)控基因Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)量顯著升高,這表明細(xì)胞凋亡在心肌缺血再灌注損傷的過程中起到了關(guān)鍵作用。

1.2.4 細(xì)胞自噬 多年來,人們對致死性的I/R 損傷的治療著力于如何減輕損傷所引起的細(xì)胞壞死和Ⅰ型程序性細(xì)胞死亡上。然而隨著對自噬(Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡)研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)這一細(xì)胞內(nèi)能量、物質(zhì)的自我代謝過程在對抗心肌缺血再灌注損傷及梗死后心臟重構(gòu)和恢復(fù)上起著重要作用,為人們治療缺血再灌注損傷提供了新的治療靶點(diǎn)。自噬的過程大致可分為4 個階段。第一階段：在饑餓等應(yīng)激狀體下,Ⅲ型磷脂酰肌醇3 激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)被激活,哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)受到抑制,誘導(dǎo)自噬發(fā)生。第二階段：PI3K 和Beclin1 等自噬相關(guān)基因(Atg)蛋白結(jié)合組裝,并不斷延長,包裹降解物質(zhì)形成自噬體。此時電鏡下可觀察到獨(dú)特的雙層膜結(jié)構(gòu)小體,因此通過檢測和評估小體的數(shù)量可作為評估自噬活性的金標(biāo)準(zhǔn)［5］,而Beclin 1 成為自噬增加的重要標(biāo)志之一［6,7］。另一方面Atg8,也稱為微管相關(guān)蛋白輕鏈3 (microtubuleassociated protein light chain 3,LC3),被水解激活成胞質(zhì)可溶性的LC3-Ⅰ。LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3-Ⅱ,其與其他Atg 蛋白錨定在自噬體膜上,是促進(jìn)自噬體延長及成熟的關(guān)鍵元素。因此通過熒光標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的含量可以看作是自噬發(fā)生的依據(jù)［8］。第三階段：自噬體和溶酶體融合形成自噬溶酶體。第四階段：自噬溶酶體內(nèi)的物質(zhì)被降解并被機(jī)體再利用。P62 同樣是自噬過程中重要的標(biāo)記蛋白。它作為連接LC3 和泛素化物質(zhì)的紐帶,并入成熟的自噬體中,并被自噬溶酶體降解。它能很好的反映細(xì)胞內(nèi)被降解物的清除程度。P62 含量的升高意味著細(xì)胞內(nèi)降解物的清除不足,自噬過程受到抑制,有研究發(fā)現(xiàn)其與自噬程度有良好的負(fù)相關(guān)性［9,10］。Matsui 等［11］結(jié)扎大鼠冠狀動脈20 min 后發(fā)現(xiàn),在缺血心肌部分用免疫熒光標(biāo)測LC3-Ⅱ,其含量明顯大于非缺血心肌部分。在其他離體心肌細(xì)胞及動物模型實(shí)驗(yàn)上,通過電鏡及免疫標(biāo)測LC3-Ⅱ同樣也觀察到自噬的上調(diào)［12］。雖然有部分學(xué)者提出了不同的聲音,認(rèn)為自噬的上調(diào)對心肌的作用依賴于缺血的程度、持續(xù)時間,甚至還與受損的細(xì)胞類型及缺血部位密切相關(guān)。在一些實(shí)驗(yàn)中,研究者發(fā)現(xiàn)自噬的過度表達(dá)不利于心肌細(xì)胞的存活、細(xì)胞凋亡的抑制以及梗死面積的控制［13］。

2 復(fù)方丹參滴丸概況

復(fù)方丹參滴丸是一種采用現(xiàn)代藥學(xué)制劑技術(shù)研制的純中藥滴丸劑,主要含有丹參素、丹參酮ⅡA、三七、皂苷等有效成分。丹參,味苦微寒,有涼血消腫、養(yǎng)血安神的功效。三七,味苦甘,性溫,有止血止痛、活血化瘀作用。冰片為化學(xué)合成物,可引導(dǎo)其他藥物進(jìn)入靶點(diǎn)以發(fā)揮藥效,具有開竅醒神、清熱止痛的作用［14］。研究表明,復(fù)方丹參滴丸中以丹參素為主的水溶性成分具有抗血小板聚集,擴(kuò)張冠狀動脈,保護(hù)心肌缺血作用。而以丹參酮ⅡA 為主的脂溶性成分可明顯減少心肌梗死面積,刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生NO 并且能抑制血管緊張素Ⅱ引起的內(nèi)皮細(xì)胞增生［15］。皂苷類成分具有改善血流動力學(xué),保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞,抗血栓形成等功能［16］。在已完成的美國FDA Ⅲ期實(shí)驗(yàn)中,復(fù)方丹參滴丸能顯著提高最大運(yùn)動耐受時間和減少心絞痛發(fā)作次數(shù)(T89-07-CAESA,http://clinicaltrials.gov/)。

3 復(fù)方丹參滴丸用于I/R 損傷治療的分子機(jī)制

3.1 抗氧化作用 趙倩等［17］通過構(gòu)建心肌缺血再灌注 SD 大鼠模型,再灌注結(jié)束后檢測血清肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)的活力,并采用“伊文氏藍(lán)-TTC”法測量計算心肌梗死面積,發(fā)現(xiàn)復(fù)方丹參滴丸和缺血后處理均可以減少心肌梗死面積,減少血清CK、LDH 的釋放(P＜0.05)。心肌缺血時會發(fā)生有氧代謝障礙,細(xì)胞內(nèi)乳酸堆積,細(xì)胞內(nèi)酸中毒,使心肌出現(xiàn)興奮-收縮耦聯(lián)障礙,心肌收縮力減弱、心室功能降低［18］。徐曼等［19］在細(xì)胞水平的研究中發(fā)現(xiàn),復(fù)方丹參滴丸可以下調(diào) Fas 基因及其配 體 FasL 蛋白表達(dá),減少凋亡,從而減輕缺氧造成的損傷。核因子NF-E2相關(guān)因子(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是重要的抗氧化蛋白,磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶 B(PI3K/AKT)信號通路是近年來發(fā)現(xiàn)的最為重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路［20］。而研究表明復(fù)方丹參滴丸可激活 PI3K/AKT 通路誘導(dǎo)AKT 磷酸化,上調(diào)Nrf2 表達(dá),從而啟動內(nèi)源性抗氧化反應(yīng),抑制氧化應(yīng)激損傷。

3.2 抗鈣超載作用和清除自由基 細(xì)胞內(nèi)Ca2+是造成心肌細(xì)胞損傷的重要因素,且其濃度和細(xì)胞受損程度密切相關(guān)［21］。藥理學(xué)研究證實(shí),復(fù)方丹參滴丸中的丹參酮可抑制動脈平滑肌細(xì)胞電壓依賴性鈣通道及受體門控型鈣通道,發(fā)揮擴(kuò)血管效應(yīng)［22］。三七中的人參皂苷能抑制細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流和釋放,非選擇性地抑制鈣離子激動所致的心肌收縮,防止鈣超載［23］；此外,冰片可通過擴(kuò)張冠狀動脈增加冠脈血流量,緩解心肌缺血［24］。冠心病患者心肌組織缺血缺氧,OFR 生成增多,導(dǎo)致血漿中LPO 增高。采用丹參治療后,LPO明顯降低,提示丹參對于外源性O(shè)FR 能起到良好的清除作用。此外,丹參中主要含有丹參素、維生素E 和硒。其中丹參素可明顯增強(qiáng)SOD 和谷胱甘肽過氧化物(GSH-Px)活性,維生素E 是有效的抗氧化劑,硒是GSH-Px 的重要組成成分且可加強(qiáng)維生素E 的抗氧化作用。另外,復(fù)方組分中的三七皂苷也具有一定的抗氧化能力進(jìn)而保護(hù)組織細(xì)胞［25］。

3.3 調(diào)控細(xì)胞自噬 自噬是一個高度保守的細(xì)胞自我代謝過程,在機(jī)體處于饑餓、能量缺乏及代謝應(yīng)激時將衰老、損傷的細(xì)胞器或錯誤折疊的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體進(jìn)行降解,再將降解物供機(jī)體利用,維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定［5］。當(dāng)心肌在一定程度的缺血再灌注的條件下,心肌細(xì)胞能量缺乏,Ca2+超載,活性氧自由基增多,觸發(fā)自噬的發(fā)生［26］。目前大部分的研究表明自噬的上調(diào)和細(xì)胞膜的完整、線粒體膜電位的穩(wěn)定、延遲不可逆細(xì)胞損傷的啟動等密切相關(guān),同時自噬的上調(diào)可清除受損的細(xì)胞器,為心肌細(xì)胞提供代謝所需的能量和物質(zhì),減輕缺血再灌注對心肌的損傷。實(shí)驗(yàn)證明,經(jīng)缺血再灌注處理后的大鼠心肌細(xì)胞因自噬的缺失會導(dǎo)致心肌病變［13,27］。而通過敲除抑制自噬的相關(guān)基因后發(fā)現(xiàn),自噬的增強(qiáng)能夠減輕缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞的凋亡,同時很好的改善遠(yuǎn)期心臟的重構(gòu)［27］。在Ca2+誘發(fā)心肌細(xì)胞自噬方面,有文獻(xiàn)報道鈣再灌注期線粒體的Ca2+超載可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的自噬活性,加重心肌細(xì)胞的損傷。而復(fù)方丹參滴丸中的丹參素有阻滯Ca2+通道、三七總皂苷有拮抗Ca2+的作用,由此推測復(fù)方丹參滴丸有可能通過降低心肌細(xì)胞內(nèi)的Ca2+含量來影響自噬作用。此外還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)一些炎癥因子對自噬也有調(diào)控作用,如 白細(xì)胞介素6(IL-6)的過度表達(dá)會通過支持人支氣管上皮細(xì)胞中的Beclin1 和抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1 之間的相互作用阻礙自噬的發(fā)生［28］。而實(shí)驗(yàn)表明,復(fù)方丹參滴丸能有效地降低急性心肌梗死患者血清 IL-6 水平,抑制炎癥反應(yīng)［29］,由此認(rèn)為復(fù)方丹參滴丸可能通過調(diào)節(jié)炎癥因子來影響心肌自噬作用,從而改善心肌缺血再灌注損傷。王學(xué)莉等［30］觀察復(fù)方丹參滴丸對 I/ R 模型大鼠的心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度、SOD 和丙二醛(MDA)含量、一氧化氮(NO)含量影響試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),復(fù)方丹參滴丸在整體和細(xì)胞水平均能降低 MRI 大鼠復(fù)氧復(fù)糖心肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣熒光強(qiáng)度、提高SOD 活性(P＜0.01)、減少 MDA 生成,并適當(dāng)增加 NO 含量(P＜0.01)。說明復(fù)方丹參滴丸既保護(hù)內(nèi)源性SOD 活力,又能減輕心肌細(xì)胞膜LPO 的損傷,從而增強(qiáng)了心肌細(xì)胞的抗OFR 損傷能力,保持心肌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性,避免了心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載及減少心肌細(xì)胞不可逆性損傷。

4 小結(jié)

復(fù)方丹參滴丸是根據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)和中醫(yī)傳統(tǒng)理論研制而成的一種中藥滴丸劑,是首個通過美國FDAⅢ期臨床試驗(yàn)的中成藥。目前復(fù)方丹參滴丸用于冠心病尤其是I/R 損傷治療的分子機(jī)制尚未完全清楚,涉及多種炎癥因子、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞因子、凋亡相關(guān)蛋白、生長因子以及生物酶等多種生物因子的調(diào)控,間接說明復(fù)方丹參滴丸是通過多靶點(diǎn)作用起到改善心肌缺血再灌注損傷的作用。相信隨著更多越來越深入的基礎(chǔ)研究及高質(zhì)量、大規(guī)模的臨床研究的開展,復(fù)方丹參滴丸對于I/R 的作用機(jī)制將不斷完善。