血凝和血凝抑制試驗影響因素及解決方法

胡秋霞

（長葛市動物疫病預防控制中心，河南 長葛461500）

1 血凝試驗中常見的問題

1.1 抗原的配制與標定

如果用凍干血凝抗原做試驗時，要按照瓶簽要求的量加入注射用水或滅菌用純化水（有時加入0.9%生理鹽水），搖勻靜置備用。在反應板上同時做3份標定抗原效價，嚴格按照操作規程進行操作，在倍比稀釋過程中避免產氣溶膠，最好是每孔稀釋次數一致，加入1%紅細胞懸液時，邊加邊搖勻，然后放到微量振蕩器上混合1 min，避免液體濺出。室溫20～25 ℃靜置20～30 min 或2～8 ℃45～60 min。在對照孔紅細胞顯著呈鈕扣狀時判定結果。

1.2 標定抗原效價的結果判定

將反應板傾斜60°，觀察紅細胞有無淚珠狀流淌，凡是有流淌的都不能算成100%凝集。掌握100%紅細胞凝集這點很重要，如果終點孔中心有點狀沉集，都對以后的試驗有較大影響。

2 血凝抑制試驗中常見問題

2.1 4單位抗原的制備

根據血凝效價結果配制相應比例的抗原稀釋液：即4單位抗原。如抗原效價為1∶128，則應將抗原做256÷4=64倍稀釋。

2.2 4單位抗原的校正

為保證4 單位抗原配制準確，需做回歸試驗。方法為：

2.2.1 首先用微量移液器向反應板的第2孔至第6孔加生理鹽水25 μl，第1孔不加。

2.2.2 用微量移液器吸取4單位抗原25 μl分別加入第1孔、第2孔，從第2孔開始倍比稀釋5～6次，然后吸出25 μl至第3孔，依次倍比稀釋到第5孔，棄去25 μl。

2.2.3 用微量移液器再吸取1%紅細胞懸液依次加入1～6孔，每孔25 μl。

2.2.4 于微量震蕩器上震蕩1 min，室溫靜置30 min 后觀察結果。

2.2.5 結果觀察：第1、2、3孔為完全凝集，第4孔紅細胞為50%沉淀，第5孔為對照完全沉淀，如果出現以上結果表明4單位抗原配制準確，校正成立。

2.2.6 通過多次試驗比對證明，配制4 單位抗原后，按照血凝抑制試驗操作規程測定標準陽性血清效價，血凝抗原和對照的陽性血清效價一般大于等于7 log 2，兩者效價基本平行一致，相差±≤1 log 2滴度，此時也可證明4單位抗原配制準確。

2.3 待檢血清的處理

新鮮的樣品一般不需要處理，如果是冷凍保存的血清樣品，解凍后出現分層現象時要搖勻才能用于檢測。

2.4 血清對照

每次做HI 試驗時，都要做陽性血清對照和陰性血清對照，不需要每板都做，一次做兩份陽性和陰性血清對照即可，陽性對照孔血清誤差不超過±1個滴度，陰性對照血清效價不高于2 log 2時，試驗結果才有效。

2.5 加樣品稀釋過程中應注意的問題

倍比稀釋過程中如果混合不均勻，也會使結果出現差異，用微量移液器吹打時避免產生氣泡和液體的濺出，加4單位病毒抗原和1%紅細胞懸液時要避免移液器的滴頭與孔內的液體接觸，為減少交叉污染，可以從低倍孔往高倍孔方向加樣。加入1%紅細胞懸液時要邊搖邊加，保證所加的樣品量和濃度準確一致。4 單位樣品配制后要在2h內用完。

2.6 反應溫度和時間

加入抗原后20～25 ℃靜置至少30 min，加入1%紅細胞懸液后震蕩混勻，靜置20～30 min，根據對照孔紅細胞呈明顯鈕扣狀沉于孔底時迅速判定結果。

2.7 結果判定

將反應板傾斜，從背側觀察紅細胞是否呈淚珠狀流下，以完全抑制4單位抗原的最高血清稀釋倍數判為該血清的HI效價。當陽性對血清對照孔與已知效價誤差不超過±1個滴度，陰性對照血清效價不高于2 log 2時，試驗方可成立。

總的來說，只要1%紅細胞懸液和4 單位病毒抗原配制準確，按照試驗操作規程規范操作，一般情況下試驗都會成立。出現問題時要認真分析，綜合考慮各個環節的影響因素，及時總結為以后的試驗積累數據和經驗，只有這樣才能不斷提高實驗室檢測能力。