羊耳菊提取物主要活性成分在大鼠體內的組織分布研究

呂 婷，楊淑婷，陸 苑，鞏仔鵬，李勇軍，曹 闖，王永林 *

1貴州醫科大學 貴州省藥物制劑重點實驗室/省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室；2貴州醫科大學 民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心；3貴州醫科大學 藥學院，貴陽 550004

羊耳菊為菊科植物羊耳菊(InulacappaDC.)的新鮮或干燥全草。主治疏風散熱，解毒消腫。用于感冒發熱，咽喉腫痛，風濕疼痛，癰瘡疔毒，乳癰[1]。國內已有文獻報道了羊耳菊藥材的主要成分是黃酮類、酚酸類、香豆素和揮發油等[2- 5]，對羊耳菊提取物的抗菌抗炎活性的研究發現，羊耳菊提取物能夠有效的抑制金黃色葡萄球菌，并有效抑制細胞釋放NO產生抗炎作用[6,7]。課題組前期對羊耳菊進行了大量研究，確定羊耳菊活性部位為60%乙醇提取，用60%乙醇經D101型大孔樹脂吸附洗脫得到；通過相似度評價系統確定了多批提取物中7個峰面積比較大的共有峰，分別為酚酸類4，5- 二咖啡酰基奎寧酸、新綠原酸、綠原酸、3，4- 二咖啡酰基奎寧酸、1，3- 二咖啡酰基奎寧酸、隱綠原酸，以及黃酮類木犀草苷，并對羊耳菊提取物不同模型的腸吸收以及代謝物的分析進行了研究[9- 11]。

藥物經胃腸道被吸收進入機體后，通過循環系統送達各個組織器官，藥物組織分布的特點除了與藥物本身的理化性質有關，還與藥物和組織的親和力等因素有密切的關系。因此，了解藥物在組織的分布對新藥的開發有重要意義[8]。國內外已有文獻報道過綠原酸、木樨草甘等在體內的組織分布情況[12,13]，其主要分布組織和達到峰值的時間并不相同。本實驗在建立UPLC- MS /MS 同時測定大鼠組織中7個代表成分含量的基礎上，研究大鼠灌胃羊耳菊提取物后這7個代表成分(化學結構如圖1所示)在大鼠體內的組織分布，探討羊耳菊提取物在大鼠體內的分布特征，為羊耳菊提取物的深度開發和臨床準確、安全及合理用藥提供參考。

1 材料

1.1 儀器

超高液相色譜- 三重四級桿質譜聯用儀(美國Waters公司)；MTN- 2800D型氮吹濃縮裝置(天津奧特塞恩斯儀器有限公司)；Allegra 64R低溫高速離心機(美國Beckman Coulter公司)；可調高速勻漿機(FSH- 2A普瑞斯機械有限公司)。

圖1 七個指標成分的化學結構Fig.1 Chemical structures of seven index components

1.2 藥物與試劑

葛根素、木犀草苷、綠原酸(批號：110752- 201514、111720- 201408、110753- 201415)購于中國食品藥品檢定研究院，新綠原酸、隱綠原酸、1，3- 二咖啡酰基奎寧酸、3，4- 二咖啡酰基奎寧酸和4，5- 二咖啡酰基奎寧酸(批號：X20- 20141012、Y58- 20141012、1384- 101215、1384- 101215、1384- 101215)均購于中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心；羊耳菊活性部位(自制，批號：20150316)；Cyclosporin A(Biotopped，批號：201412)；羊耳菊藥材購自貴州龍里縣，由貴州醫科大學藥學院生藥學教研室龍慶德副教授鑒定為菊科植物羊耳菊Inulacappa(Buch.Ham.exD.Don)DC.的干燥全草。

1.3 動物

健康SD大鼠24只，♀♂兼用，體質量為250±20 g，由重慶騰鑫生物技術有限公司提供，合格證號：SCXK(渝)2015- 0001。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18(2.1×50 mm，1.7 μm)；進樣量：2 μL；柱溫：45 ℃；流動相A：0.1%甲酸乙腈；流動相B：0.1%甲酸水；流速：0.25 mL/min；梯度洗脫程序：0 min～0.5 min用5% A；0.5 min～1 min用5%～15%A；1 min～3.8 min用15%～18%A；3.8 ～4.0 min用18%～90%A；4.0～5.0 min用90%～5%A。

2.2 質譜條件

電噴霧電離源(ESI)；去溶劑氣(氮氣800 L/h)，去溶劑氣溫度(550 ℃)，碰撞氣(氬氣，50 L/hr)，掃描方式為多反應離子監測模式(MRM)，檢測離子為4，5- 二咖啡酰基奎寧酸m/z515.29～173.08，新綠原酸m/z353.15～191.03，綠原酸m/z353.17～191.04，3，4- 二咖啡酰基奎寧酸m/z515.27～353.15，1，3- 二咖啡酰基奎寧酸m/z515.29～353.16，隱綠原酸m/z353.21～173.08，木樨草甘m/z447.29～2875.02，內標物葛根素m/z417.16～297.07，錐孔電壓分別為35、25、25、25、35、35、25、30 V，碰撞電壓分別為25、15、15、15、17、17、15、15 eV。

2.3 溶液的配制

內標溶液：精密稱取葛根素5.7 mg，置于5 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得濃度為1.14 mg/mL的葛根素儲備液。精密吸取適量儲備液逐級稀釋至濃度為4 μg/mL的內標溶液。

對照品溶液：分別精密稱取4，5- 二咖啡酰基奎寧酸(5.08 mg)、新綠原酸(5.37 mg)、綠原酸(5.17 mg)、3，4- 二咖啡酰基奎寧酸(5.11 mg)、1，3- 二咖啡酰基奎寧酸(5.10 mg)、隱綠原酸(5.10 mg)對照品，分別置于5 mL棕色容量瓶中，加甲醇分別溶解并稀釋至刻度；另精密稱取木犀草苷(5.11 mg)對照品，置于5 mL棕色容量瓶中，加75%乙醇溶解并稀釋至刻度。分別得到濃度為1.02 mg/mL(4，5- 二咖啡酰基奎寧酸)、1.07 mg/mL(新綠原酸)、1.03 mg/mL(綠原酸)、1.02 mg/mL(3，4- 二咖啡酰基奎寧酸)、1.02 mg/mL(1，3- 二咖啡酰基奎寧酸)、1.02 mg/mL(隱綠原酸)、1.03 mg/mL(木犀草苷)的對照品儲備液。置于冰箱- 20 ℃保存，備用。分別精密吸取7種對照品儲備液適量，用甲醇逐級稀釋至系列濃度的標準溶液。

2.4 組織樣品收集

健康SD大鼠24只，雄性，體重(230±20)g，給藥前12小時禁食，自由飲水。隨機分為4組(空白對照組、0.5 h組、1.5 h組、5 h組，每組6只)，按照10 mL/kg灌服羊耳菊有效組分提取物(給藥劑量為100 g/kg生藥量)分別于次日灌胃給以羊耳菊提取物前、給藥后0.5、1.5、5 h取出各臟器組織，相應的心、肝、脾、肺、腎、小腸、腦、骨骼肌、胃，用0.9% NaCl溶液洗去表面浮血，濾紙吸干，精密稱取各組織0.5 g，并用生理鹽水制成25%勻漿，組織勻漿液超聲5 min后，5 000 rpm離心10 min，分離上清液于- 80℃冰箱儲存，待處理。

2.5 組織樣品處理

取上述組織勻漿上層液300 μL，置于1.5 mL離心管中，加入20%甲酸水60 μL，渦混，加入內標溶液20 μL(葛根素4.56 μg/mL)，渦混后加入900 μL甲醇沉淀蛋白，渦混5 min，60 HZ超聲5 min，10 000 rpm離心6 min，取上清液用氮吹儀在40 ℃下吹干，殘渣用300 μL 50% 甲醇水復溶，渦混3 min，超聲3 min，10 000 rpm離心10 min，取上清液進UPLC- MS/MS分析。

3 結果

3.1 方法學驗證

方法學結果表明，以小腸組織為例，典型色譜結果見圖2，組織中所含內源性物質不干擾被測物和內標物的測定，分離度高，被測物峰型好，提示該方法專屬性良好；7種指標成分在相應的線性范圍內線性關系良好，相關系數r均大于0.99，各成分的定量限分別為4，5- 二咖啡酰基奎寧酸17.21 ng/mL、新綠原酸18.19 ng/mL、綠原酸17.51 ng/mL、3，4- 二咖啡酰基奎寧酸17.31 ng/mL、1，3- 二咖啡酰基奎寧酸17.27 ng/mL、隱綠原酸17.27 ng/mL、木犀草苷17.31 ng/mL；各成分的檢出限分為4，5- 二咖啡酰基奎寧酸5.74 ng/mL、新綠原酸6.06 ng/mL、綠原酸5.84 ng/mL、3，4- 二咖啡酰基奎寧酸5.77 ng/mL、1，3- 二咖啡酰基奎寧酸5.76 ng/mL、隱綠原酸5.76 ng/mL、木犀草苷5.77 ng/mL；在各組織勻漿液中的日內和日間精密度RSD值均小于15%，準確度范圍為90%～110%，提示該方法準確度、精密度良好，符合生物樣品分析方法要求；各組織中提取回收率良好，不存在明顯的基質效應，均符合生物樣品分析方法要求；各組織樣品在自動進樣器中放置6 h和反復凍融3次后，樣品中7個成分的峰面積偏差均在15%以內，表明各組織勻漿液中待測物在自動進樣器中放置6 h和反復凍融3次后的穩定性良好。

圖2 典型UPLC- MS/MS圖譜Fig.2 Typical UPLC- MS/MS chromatogram 注：A.空白小腸樣品；B.空白小腸加對照品溶液；C.0.5h小腸樣品；1.綠原酸，2.新綠原酸，3.隱綠原酸，4.葛根素，5.1，3- 二咖啡酰基奎寧酸，6.木犀草苷，7.3，4- 二咖啡酰基奎寧酸，8.4，5- 二咖啡酰基奎寧酸。Note：A.blank small intestine sample;B.blank small intestine plus control solution;C.small intestine sample under 0.5h;1.chlorogenic acid,2.neochlorogenic acid,3.cryptochlorogenic acid,4.puerarin,5.1,3- two caffeoyl quinic acid,6.galuteolin,7.3,4- two caffeoyl quinic acid,8.4,5- two caffeoyl quinic acid.

3.2 組織分布實驗結果

按照“2.5”項下處理各組織樣品，照“2.2”項下分析條件進樣測定并計算給藥后大鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎、腦、小腸、肌肉和胃組織中7種成分的濃度，結果以每1 g 組織含有被測成分的量(ng)表示。

3.2.1 羊耳菊活性部位中新綠原酸的組織分布

羊耳菊活性部位中新綠原酸的組織分布結果見表1所示：新綠原酸不同時間下在心、肝、脾、肺、腎、小腸、肌、胃中均有分布，其中在胃腸道分布較多，其他組織較少，腦組織未檢測到。不同組織中的含量(ng/g)在0.5 h時分別為小腸>胃>腎>肌>肺>脾>心>肝；在1.5 h時分別為胃>小腸>腎>肌>脾>心>肺>肝；在5 h時分別為胃>腎>肌>脾>心>肺。

表1 不同時間下新綠原酸在各組織中的分布(Mean±SD，n = 6)

注：“NA”表示低于檢出限，“- ”表示低于檢測限。

Note：“NA” is below LLOD,“- ” is below LLOQ.

3.2.2 羊耳菊活性部位中綠原酸的組織分布

羊耳菊活性部位中綠原酸的組織分布結果見表2所示：綠原酸不同時間下在心、肝、脾、肺、腎、小腸、肌、胃中均有分布，其中在胃腸道分布較多，其他組織較少，腦組織中未檢測到。不同組織中的含量(ng/g)在0.5 h時分別為小腸>胃>腎>心>肌>脾>肺；在1.5 h時分別為胃>小腸>腎>肌>肝>脾>心>肺；在5 h時分別為胃>腎>肌>脾>肺。

表2 不同時間下綠原酸在各組織中的分布(Mean±SD，n= 6)

注：“NA”表示低于檢出限，“- ”表示低于檢測限。

Note：“NA” is below LLOD,“- ” is below LLOQ.

3.2.3 羊耳菊活性部位中隱綠原酸的組織分布

羊耳菊活性部位中隱綠原酸的組織分布結果見表3所示：隱綠原酸不同時間下在心、肝、脾、肺、腎、小腸、肌、胃中均有分布，其中在胃腸道分布較多，其他組織較少，腦組織中未檢測到。不同組織中的含量(ng/g)在0.5 h時分別為小腸>胃>腎>脾>肝>肺>肌>心；在1.5 h時分別為胃>小腸>腎>肝>肌>脾>肺>心；在5 h時分別為胃>腎>肌>脾>肺>肝。

表3 不同時間隱綠原酸在各組織中的分布(Mean±SD，n = 6)

注：“NA”表示低于檢出限，“- ”表示低于檢測限。

Note：“NA” is below LLOD,“- ” is below LLOQ.

3.2.4 羊耳菊活性部位中1，3- 二咖啡酰基奎寧酸的組織分布

羊耳菊活性部位中1，3- 二咖啡酰基奎寧酸的組織分布結果見表4所示：1，3- 二咖啡酰基奎寧酸不同時間下在心、肝、脾、肺、腎、小腸、肌、胃中均有分布，其中在胃腸道分布較多，其他組織較少，腦組織中未檢測到。不同組織中的含量(ng/g)在0.5 h時分別為小腸>胃>腎>心>肝>肌>脾>肺；在1.5 h時分別為胃>小腸>腎>肝>肌>脾>心>肺；在5 h時分別為胃>腎>肌>脾>肺>心。

表4 不同時間下1，3- 二咖啡酰基奎寧酸在各組織中的分布(Mean±SD，n = 6)

注：“NA”表示低于檢出限，“- ”表示低于檢測限。

Note：“NA” is below LLOD,“- ” is below LLOQ.

3.2.5 羊耳菊活性部位中3，4- 二咖啡酰基奎寧酸的組織分布

羊耳菊活性部位中3，4- 二咖啡酰基奎寧酸的組織分布結果見表5所示：3，4- 二咖啡酰基奎寧酸不同時間下在心、肝、脾、肺、腎、小腸、肌、胃中均有分布，其中在胃腸道分布較多，其他組織較少，腦組織中未檢測到。不同組織中的含量(ng/g)在0.5 h時分別為小腸>胃>腎>肌>肝>脾>心>肺；在1.5 h時分別為胃>腎>小腸>肝>肌>脾>心>肺；在5 h時分別為胃>腎>肌>心>肺>脾。

表5 不同時間下3，4- 二咖啡酰基奎寧酸在各組織中的分布(Mean±SD，n = 6)

注：“NA”表示低于檢出限，“- ”表示低于檢測限。

Note：“NA” is below LLOD,“- ” is below LLOQ.

3.2.6 羊耳菊活性部位中4，5- 二咖啡酰基奎寧酸的組織分布

羊耳菊活性部位中4，5- 二咖啡酰基奎寧酸的組織分布結果見表6所示：4，5- 二咖啡酰基奎寧酸不同時間下在心、肝、脾、肺、腎、小腸、肌、胃中均有分布，其中在胃腸道分布較多，其他組織較少，腦組織中未檢測到。不同組織中的含量(ng/g)在0.5 h時分別為小腸>胃>腎>心>肝>肌>脾；在1.5 h時分別為胃>腎>肝>心>肌>脾>肺>小腸；在5 h時分別為腎>胃>心>肌>肺>肝。

表6 不同時間4，5- 二咖啡酰基奎寧酸在各組織中的分布(Mean±SD，n = 6)

注：“NA”表示低于檢出限，“- ”表示低于檢測限。

Note：“NA” is below LLOD,“- ” is below LLOQ.

3.2.7 羊耳菊活性部位中木犀草苷的組織分布

羊耳菊活性部位中木犀草苷的組織分布結果見表7所示：木犀草苷不同時間下在心、肝、脾、肺、腎、肌、胃中均有分布，其中在胃分布較多，其他組織較少，小腸與腦組織中未檢測到。不同組織中的含量(ng/g)在0.5 h時分別為胃>小腸>心>腎>肝>脾；在1.5 h時分別為胃>肝>心>脾>腎>小腸>肺；在5 h時分別為心>腎>胃>脾>肺。

表7 不同時間木犀草苷在各組織中的分布(Mean±SD，n = 6)

續表7(Continued Tab.7)

組織Tissue 0.5 h(ng/g)1.5 h(ng/g)5 h(ng/g)肺 Lung-17.87±1.3918.79±1.75腎 Kidney42.22±4.2143.30±2.7650.59±6.72腦 BrainNANANA小腸Small intestien163.64±42.1118.31±4.76-肌 Muscle---胃 Stomach686.24±80.241 614.64±83.2625.92±8.66

注：“NA”表示低于檢出限，“- ”表示低于檢測限。

Note：“NA” is below LLOD,“- ” is below LLOQ.

實驗結果表明，大鼠灌胃給以羊耳菊活性部位提取物后，7種成分的吸收、分布、清除較為迅速，各指標成分在體內無蓄積情況。在給藥30 min內，均在小腸內迅速達到峰濃度，給藥1.5 h后，7種成分均在脾、胃等組織分布較快。

4 討論

本研究采用UPLC- MS/MS建立了同時測定羊耳菊活性部位中7種指標成分(新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、1，3- 二咖啡酰基奎寧酸、3，4- 二咖啡酰基奎寧酸、4，5- 二咖啡酰基奎寧酸、木犀草苷)在大鼠體內組織分布的分析方法，經方法學驗證，該方法簡便快速，專屬性強，靈敏度高，分析效率高，適合高通量的生物樣品分析。

據報道，綠原酸及其類似物的吸收主要在小腸和結腸，在微生物的作用下轉化成多種代謝產物[14]。在本實驗中，0.5 h時綠原酸、新綠原酸，隱綠原酸、1，3- 二咖啡酰基奎寧酸、3，4- 二咖啡酰基奎寧酸和4，5- 二咖啡酰基奎寧酸在小腸的濃度最高，證明口服羊耳菊提取物后，6種成分的主要吸收部位在小腸。1.5 h時，小腸內的濃度明顯降低，這可能是因為綠原酸類活性物質容易被腸道菌群水解，發生酯基位置異構和脫羥基等反應[15]，從而導致此類化合物的濃度明顯降低。而在5 h時，6種成分在小腸的含量均低于定量限，證明此時6種成分在小腸內幾乎消除完畢。與此同時，實驗室進行了羊耳菊灌胃后的藥動學實驗，后主要的藥動學數據如表8所示。

表8 7種成分在正常大鼠血漿中的主要藥動學數據(Mean±SD，n = 6)

由實驗結果可知，7種成分主要分布在胃、小腸和腎組織中，對腎臟表現出較強的親和力，推測腎臟可能是羊耳菊提取物的主要排泄器官之一；木犀草苷在肌肉組織中含量較低，說明其吸收入血后迅速分布于其他組織，對肌肉組織親和力較差；同時腦組織中未檢測到該7種成分，但已有文獻[12,13]報道過綠原酸和木樨草甘能夠入腦，本次實驗在腦組織中未檢測出該7種成分，原因是含量低于最低定量限，無法做定量分析；同時，本次實驗中，綠原酸、新綠原酸，隱綠原酸、1，3- 二咖啡酰基奎寧酸、3，4- 二咖啡酰基奎寧酸和4，5- 二咖啡酰基奎寧酸6個酚酸類成分除小腸與胃兩個吸收部位外，主要分布組織為腎臟，這與文獻[16,17]報道的一致；6種酚酸類成分在0.5 h時在腎臟濃度達到峰值，之后的濃度逐漸減少，這說明酚酸類成分自尿液中排泄比較迅速[18]，在腎臟內不易蓄積。由此可知，羊耳菊中酚酸類、黃酮類成分在大鼠體內的主要分布器官具有一定相似性，同時又存在差異，一定程度上體現了中藥多成分、多靶點的作用特點，為進一步研究開發和臨床應用提高依據。然而，本實驗最后一個取樣點時，新綠原酸在心臟組織、3，4- 二咖啡酰基奎寧酸在心臟和肺組織、4，5- 二咖啡酰基奎寧酸在肺組織、木犀草苷在肺和腎組織分別達到了5 h內的濃度峰值，因此無法預測其后續變化趨勢。下一步實驗將針對這四種成分，延長取樣時間點，測定其在相應組織中的濃度，以期明確該成分在組織中的后續變化，為羊耳菊的臨床合理使用提供參考。