白肉靈芝水提物對衰老大鼠皮膚的作用研究

王 昱，何九軍，張宗舟

隴南師范高等專科學校農林技術學院 隴南特色農業生物資源研究開發中心，成縣 742500

人體衰老是一個全方位、多因素、系統的不可逆的過程，常伴隨著結構的退行性變和機能的衰退。皮膚的衰老則表現為皮膚變薄、彈性減退、皺紋出現、干燥粗糙、色素沉著、血管突顯等臨床癥狀[1]。目前文獻報道，皮膚的衰老與氧自由基損傷、免疫力衰退、端粒酶活性降低、炎性浸潤等有關[2,3]。在延緩皮膚衰老的方面，外科手術運用皮膚提緊術、肉毒素注射、膠原皮下注射等方法治療，但有一定的風險及副作用。中醫從疏通經絡氣血、調整臟腑功能等入手[4]，是治療皮膚衰老的有效方法之一。所以，將傳統中醫藥的抗衰防老手段與現代科學技術相結合，開發用于皮膚保健及抗衰老的功能性食品是當前重要的課題。

肉靈芝學名太歲，《本草綱目》記載肉靈芝既可食用，也可入藥，有“輕身不老、延年神仙”功效?！渡褶r本草經》也提到肉靈芝無毒，能補中益氣、增智慧[5]。近年來的研究表明，肉靈芝有效成分包括吡咯喹啉醌、氨基酸、維生素、微量元素等，對高血壓、動脈硬化、癌癥、風濕病等有一定作用，是一種高蛋白、低脂肪、具有豐富的鈣、鐵、鋅等微量元素的生物體[6]。Xiong等[7]研究表明肉靈芝中的生物活性成分穩定性高且易通過機體血腦屏障，能促進新生神經元的發生，在治療神經退行性疾病中具有更為廣闊的前景。為了進一步探討GLAE的藥用和保健作用，本研究運用生物顯微技術、彗星電泳、定量PCR等技術對GLAE的抗衰老作用機制進行了研究。

1 材料與方法

1.1 白肉靈芝水提物制備

取本實驗室培養的白肉靈芝，烘干(35 ℃)子實體，提取DNA后擴增、電泳檢測、條帶純化、測序(上海生物工程有限公司)。鑒定結果表明該樣本為白肉靈芝(Ganodermaleucocontextum)。根據文獻[7]，將白肉靈芝子實體干品粉碎，過篩(60 目)、提取(96 ℃水浴)、離心，收集上清，過濾，濾液冷凍干燥，得到白肉靈芝水提物。

1.2 動物模型建立與給藥

50只健康SD大鼠，雌雄各半，許可證號：SCXK(甘)2005-0007，體質量200～250 g，適應性飼養一周后隨機分為5組，每組10只：對照組、模型組、GLAE低劑量組、GLAE中劑量組和GLAE高劑量組。模型組和GLAE組大鼠采用頸背部皮下注射D-半乳糖(北京優尼康生物科技，批號MG05201)溶液300 mg/kg·bw[3]，同時GLAE低、中、高劑量組分別灌胃(50、100 和200 mg /kg·bw)的GLAE[8]，對照組每天注射等量的0.9% 生理鹽水，連續處理7周。

1.3 組織學觀察

采用頸椎脫臼法處死大鼠，用 8%硫化鈉溶液脫毛后立即取大鼠背部正中皮膚修成常規大小，經4 %多聚甲醛液固定、石蠟包埋切片、染色后，顯微鏡觀察。

1.4 膠原蛋白含量的測定

取背部皮膚的真皮，在培養皿中用無血清HBSS液(Hanks平衡鹽緩沖溶液)沖洗，眼科剪剪碎，然后用彎頭吸管反復吹打，0.125%胰蛋白酶和 0.01%的EDTA室溫消化30 min，終止消化后棄去消化液，收集細胞按照ELISA檢測試劑盒(ELx800，美國BioTek公司)說明書操作，檢測Ⅰ型、Ⅱ型膠原蛋白的含量。

1.5 彗星電泳檢測皮膚細胞DAN的損傷

根據文獻制片[9]：第一、二層分別鋪瓊脂糖和上述制備的細胞懸液。將制備好的載玻片置于4 ℃固定30 min 后，浸沒于4 ℃預冷的裂解液(2.5 M NaCl、100 mM Na2EDTA、10 mM Tris-HCl pH 10、1%肌氨酸鈉、1%Triton和1%DMSO)中裂解2 h。在4 ℃盛有堿性電泳緩沖液(1 mM EDTA，300 mM NaOH)的電泳槽(DYCPZ型，北京市六一儀器廠)靜 置20 min，使DNA 解旋，然后在25 V 電壓，300 mA 電流下電泳(DYY- IB型電泳儀，北京市六一儀器廠)20 min。Tris- HCl緩沖液(4 ℃)中和至中性，用溴化乙錠(廣州化學試劑廠)溶液染色30 s～1 min，蒸餾水洗滌。在倒置熒光顯微鏡(DMI3000B，Leica)下用515～560 nm 的激發光觀察單細胞電泳圖像，每樣做3張片子，拍照觀察DNA損傷細胞(尾長大于頭部半徑的細胞)。實驗結果以彗星率%表示。

1.6 PCR檢測皮膚MAP3K5、TGF- β1和PLOD2 mRNA表達

取大鼠皮膚在2 mL 的離心管(加入1 mL Trizol)中反復研磨，離心(14 000 rpm)10 min，然后按照PCR試劑盒說明書進行酚- 氯仿抽提RNA、逆轉錄反應、實時熒光PCR擴增，最后采用 ABI 7 500 軟件分析，用2-△△Ct方法進行相對定量。(引物由上海涵悅生物科技有限公司設計，上海生工生物技術有限公司合成，引物信息見表1。Taka Ra公司提供RNA抽提試劑盒、反轉錄試劑、定量PCR試劑)。

表1 目的基因引物序列

1.2.8 數據處理

2 結果

2.1 GLAE對大鼠皮膚組織結構的影響

對照組大鼠皮膚組織分層清楚、結構完整，真皮層的膠原纖維排列整齊、分布均勻，皮膚附屬器數量較多。模型組大鼠表皮變薄，結構不完整，皮膚附屬器減少；真皮和皮下結締組織被致密、無彈性的纖維化組織所替代，皮膚纖維化嚴重。GLAE高劑量組大鼠皮膚組織形態接近對照組，表皮較厚，組織結構完整，皮膚附屬器較多(見圖1)。

圖1 GLAE對大鼠皮膚組織病理學影響Fig.1 Effect of GLAE on the skin histopathology in rats注：A.對照組；B.模型組；C.GLAE高劑量組，標尺示50 μm。Note:A.control group;B.model group;C.GLAE high- dose group,bar=50 μm.

2.2 各實驗組大鼠皮膚Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白的含量

與對照組相比，模型組成纖維細胞Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白含量顯著降低(P< 0.01)。與模型組相比，GLAE低、中、高劑量組成纖維細胞Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白含量均呈升高趨勢(P<0.01，P<0.05)(見圖2)。

2.3 各實驗組大鼠皮膚細胞的DNA損傷

彗星電泳又稱單細胞凝膠電泳，若細胞核DNA斷裂成片段，在電泳條件下，其移動的速度快于細胞核部分，從而在電泳圖上形成彗星狀圖形，尾部的長短或面積大小代表細胞核DNA損傷的程度，正常細胞的細胞核呈圓形(見圖3)。由圖4可知，各實驗組大鼠皮膚細胞的DNA均有不同程度斷裂，均出現了彗星狀圖形。與對照組相比，模型組大鼠皮膚細胞DNA的彗星率極顯著升高(P< 0.01)。與模型組相比，GLAE低、中、高劑量組大鼠皮膚的細胞DNA彗星率均呈降低趨勢(P< 0.05，P< 0.01)。

圖2 GLAE對大鼠皮膚Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白含量的影響Fig.2 Effects of GLAE on contents of skin typeⅠand type Ⅱ collagen in rats注：同列數據肩標不同小寫字母表示差異顯著(P < 0.05)；肩標不同大寫字母表示差異極顯著(P < 0.01)；肩標相同字母或無字母標注表示差異不顯著(P > 0.05)。Note:In the same column,values with different small letter superscripts mean significant difference (P < 0.05);And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P < 0.01);While with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P > 0.05).

圖3 各實驗組大鼠皮膚細胞DNA的彗星電泳圖 Fig.3 Comet electrophoretogram of skin cell in each experimental group注：A.對照組；B.模型組；C.GLAE高劑量組，標尺示20 μm。Note:A.control group;B.model group;C.GLAE high- dose group,bar=20 μm.

圖4 GLAE對大鼠皮膚細胞DNA損傷的影響 Fig.4 Effect of GLAE on skin cell DNA damage of rats注：同列數據肩標不同小寫字母表示差異顯著(P < 0.05)；肩標不同大寫字母表示差異極顯著(P < 0.01)；肩標相同字母或無字母標注表示差異不顯著(P > 0.05)。Note:In the same column,values with different small letter superscripts mean significant difference (P < 0.05);And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P < 0.01);While with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P > 0.05).

2.4 各實驗組大鼠皮膚組織MAP3K5、TGF- β1和PLOD2 mRNA表達

由表2可知，與對照組相比，模型組大鼠皮膚組織MAP3K5和TGF-β1 mRNA表達量極顯著下降，PLOD2 mRNA表達量極顯著升高(P< 0.01)；與模型組比較，GLAE低、中、高劑量組大鼠皮膚組織MAP3K5和TGF-β1 mRNA表達量顯著升高(P< 0.05，P< 0.01)，PLOD2 mRNA表達量呈降低趨勢(P< 0.05，P< 0.01)。

表2 GLAE對大鼠皮膚組織MAP3K5、TGF- β1和PLOD2 mRNA表達的影響

注：同列數據肩標不同小寫字母表示差異顯著(P< 0.05)；肩標不同大寫字母表示差異極顯著(P< 0.01)；肩標相同字母或無字母標注表示差異不顯著(P> 0.05)。

Note:In the same column,values with different small letter superscripts mean significant difference (P< 0.05);And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P< 0.01);While with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P> 0.05).

3 討論

皮膚衰老時表現出表皮變薄、膠原纖維排列紊亂、細胞結構異常等明顯的形態學變化[10,11]。人體皮膚細胞外基質的主要成分是膠原蛋白，其中的Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白交織成網，支撐起整個皮膚，而當膠原蛋白含量降低時，皮膚的彈力明顯下降[12]。本實驗結果顯示，模型組大鼠皮膚的各層組織間層次不清楚，表皮變薄，Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白的含量降低，DNA損傷加劇。而經GLAE作用后，大鼠皮膚結構完整，表皮增厚，真皮內膠原纖維增多，排列比較緊密、整齊，DNA損傷程度明顯降低，這表明GLAE對衰老大鼠皮膚組織的損傷有明顯的保護作用。

在生理狀態下，細胞凋亡在調節機體生長發育及維持機體細胞平衡中起到了重要的調控作用，確保細胞達到最佳平衡的狀態。在病理條件下，細胞凋亡會引起機體結構發生退行性改變，引發許多老年性疾病，即與皮膚衰老存在一定的關聯性[13]。MAP3K5 基因是氧化應激誘導的細胞凋亡必需基因，參與調節炎癥反應，也可作為抑癌基因發揮促凋亡作用[14,15]。MAP3K5基因在皮膚中表達下調，皮膚細胞凋亡明顯加劇，導致皮膚病理改變[1]。因而，MAP3K5基因可能是抑制細胞凋亡、抗皮膚衰老的基因之一。轉化生長因子-βl(TGF-βl)是一種多效性、多功能性的高效生長分化因子，可以通過抑制膠原酶的活性來抑制基質降解，促進膠原合成[16]。研究表明，TGF-βl能促進成纖維細胞等間充質起源細胞增殖、抑制細胞凋亡及促進細胞外基質的合成[17]。在體外實驗中發現，血管內皮細胞生長因子、角質形成細胞生長因子和胰島素樣生長因子的水平與外源性的TGF-βl 呈正向關系[18]，成纖維細胞增殖活性率提高，I、II型膠原蛋白含量及其mRNA的表達增加，促進真皮內結構的恢復和重建[19]。本實驗結果顯示，模型組大鼠皮膚中基因MAP3K5表達顯著降低，經GLAE作用后，衰老大鼠皮膚組織中基因MAP3K5、TGF-βl表達量顯著增加，提示GLAE可通過上調MAP3K5和TGF-βl基因的表達來抑制細胞凋亡和基質降解，促進成纖維細胞增殖和膠原蛋白合成，從而發揮延緩皮膚衰老的作用。

賴氨酸羥化酶(lysyl hydrxoylase, LH)與膠原蛋白的形成及穩定有著密切的關系。LH 的主要功能是催化膠原蛋白分子中的賴氨酸羥化成羥賴氨酸，把膠原蛋白分子共價交鏈形成穩定物，大量的膠原蛋白無法降解，過度堆積在機體組織中，從而使皮膚松弛、組織纖維化等衰老表現[20]。LH 家族中的 LH1、LH2、LH3 是分別由PLOD1、PLOD2、PLOD3 編碼的，其中的PLOD2 表達量增加時，LH2 活性增強，從而促使膠原纖維過度堆積聚集[21]。本研究結果表明，模型大鼠皮膚組織中 PLOD2 基因表達顯著增加，而經GLAE作用后，其表達顯著下降，說明GLAE可通過下調 PLOD2 的表達，降低 LH2 的活性，減少膠原蛋白在皮膚組織的堆積，在增加皮膚彈性和減少皮膚皺紋形成方面有重要作用。

綜上所述，GLAE對衰老大鼠皮膚組織的損傷有明顯的保護作用，這種作用可能與增加膠原蛋白含量、抑制皮膚細胞DNA損傷、調節MAP3K5、TGF-β1和PLOD2基因的表達有關。對于肉靈芝中有效生物成分的藥用價值，目前無完備的科學解釋，還需大量的藥理驗證。