夏黑葡萄藤放置過程中化學成分的變化及可能變化機制分析

嚴思恩，趙康宏，何英杰，劉東波,3，王 蕾,4，謝紅旗,3*

1湖南農業大學園藝園林學院；2國家中醫藥管理局亞健康干預技術實驗室；3湖南省植物功能成分利用協同創新中心，長沙410128；4遼寧晟啟昊天生物醫藥科技有限公司，沈陽110000

葡萄品種夏黑(Vitisvinifera×Vitislabrusca, Summer Black)屬于歐美雜種，抗逆性強、果實無核、果皮紫黑、具有獨特香味，已成為我國的鮮食葡萄品種之一[1]。葡萄采收之后一般會對其進行修剪、整枝[2]，以提高葡萄產量與品質，修剪掉的葡萄枝蔓則被當做廢棄物進行焚燒。然而，研究發現葡萄藤中含有許多生物活性成分，如反式白藜蘆醇、ε- 葡萄素等芪類化合物以及兒茶素、表兒茶素等黃酮類化合物[3,4]。其中，芪類化合物不僅對老年癡呆與神經元細胞損傷具有良好的防治作用[5,6]，而且對癌癥與炎癥也具有一定的療效[7,8]。芪類化合物是一類植物抗毒素，當植物受到生物或非生物脅迫時能夠大量產生[9]。課題組前期研究發現葡萄藤枝蔓在整枝陰干過程中反式白藜蘆醇與ε- 葡萄素含量會發生顯著變化，但機制尚不明確[10]。本文采用UPLC- Q- TOF- MS方法對夏黑葡萄藤中的主要化學成分進行初步鑒定，并通過HPLC法對夏黑葡萄藤在放置過程中化合物的含量變化進行分析，以期揭示夏黑葡萄藤在放置過程中化合物的變化規律和化合物之間的轉化機制，為提高葡萄藤的綜合利用及探索芪類化合物的生物來源提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄藤采收于國家中藥材生產(湖南)技術中心核心基地，經唐其副教授鑒定為夏黑葡萄(Vitisvinifera×Vitislabrusca，Summer Black)。

甲醇、乙腈，(色譜純)德國Merck試劑公司；甲酸，(分析純)上海國藥集團試劑有限公司；去離子水由超純水儀(四川優普超純科技有限公司)制得。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀(美國Agilent 1260)；超高效液相色譜儀聯用四級桿串聯飛行時間質譜儀(美國Agilent 1290)；KM- 5200DV超聲儀(昆山超聲儀器有限公司)；XS205分析天平(METTLER TOLEDO)；GZ- 800- GSⅡ智能人工氣候箱；優普超純水機(UPR- 10T)。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將采收的新鮮葡萄藤枝蔓(35 cm左右)放入溫度為 20 °C、 濕度為 45%的恒溫人工氣候箱，分別在第0、2、5、10、15、20、48、80 天隨機取樣。樣品烘干后粉碎過2 號篩，備用。

1.3.2 水分測定

參照《中國藥典》2015版通則下水分測定法中第二法(烘干法)測定供試品含水量。

1.3.3 供試品溶液的制備

樣品制備參考Xie[11]提取葡萄藤中化合物的方法，并加以優化。具體操作如下，將樣品粉碎后，準確稱量5.0 g，置于250 mL磨口錐形瓶中，按料液比為1∶20加入100 mL甲醇，連瓶一起稱重記為M；再在錐形瓶外包裹上一層錫箔紙，進行超聲提取1 h；提取完成后取下錫箔紙，擦干錐形瓶外的水，待提取液冷卻至室溫時稱重，并用甲醇補足重量至M，8 000 rpm離心10 min，取上清液過0.45 μm微濾膜，得HPLC檢測用供試品溶液；取上清液過0.22 μm微濾膜，得UPLC- Q- TOF- MS分析用供試品溶液。

1.3.4 色譜條件

色譜柱為：Agilent- ZORBAX SB- C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)，流動相為0.1%甲酸水(A)～乙腈(B)，梯度洗脫，洗脫程序：0～5 min，15% B；5～8 min，15%～18% B；8～10 min，18% B；10～20 min，18%～23% B；20～25 min，23%～30% B；25～35 min，30%～40% B；40～45 min，15% B。流速0.8 mL/min，進樣量10 μL，檢測波長306 nm，柱溫30 °C。

1.3.5 質譜條件

通過優化質譜條件，采用負離子模式電噴霧電離離子源(ESI-)，TOF質量掃描范圍m/z100～3 000；載氣溫度300 °C，流速8 L/min；霧化壓力35 psi；鞘氣溫度350 °C，流速11 L/min；毛細管電壓3 500 V；碰撞誘導解離電壓175 V，設置碰撞能量梯度為15、20、25、30 eV。

2 結果與分析

2.1 葡萄藤中主要成分的初步鑒定

采用UPLC- Q- TOF- MS對葡萄藤中主要成分進行定性分析，如圖1所示，在負離子模式下總離子流圖中檢測出11 個化合物。對這些主要成分進行 MS/MS分析，詳細離子信息如表1所示。

化合物1的精確分子量為311.039 3， MS/MS結果表明：該化合物含有[M- H]-=179.034 6與[M-H]-=135.046 5碎片離子，表明該化合物中可能含有一個咖啡酸分子，其中母離子與咖啡酸分子之間的差值為132.358 4，可能是：2- 羥基- 3- 甲基- 4- 氧代戊酸。再結合Sánchez- Gómez等[12]的報道，推測出該化合物為trans- caftaric acid，分子式為C13H12O9，化合物結構式如圖2所示。

圖1 負離子模式下葡萄藤中化合物總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of compounds in grapevine under negative ion mode

化合物2與4的母離子分子量相同且碎片離子相似，但保留時間上有所差異。推測這兩種化合物互為同分異構體，該結果與Sánchez- Gómez等[12]報道的葡萄藤中兒茶素與表兒茶素精確分子量相同，且與Liu等[13]報道的兒茶素類化合物的質譜裂解規律相似，并且都含有[M- H]-=161.059 1、[M- H]-=137.021 7等特殊離子碎片，由此推測這兩種化合物分別為兒茶素與表兒茶素，本試驗使用的是反相色譜柱，因此先出峰的為極性大的化合物[14]，因此化合物2為兒茶素，化合物4為表兒茶素，分子式為C15H14O6，結構式分別如圖2所示。

化合物3的精確分子量為465.091 4，在其碎片離子中含有 [M- H]-= 285.038 6，推測可能為母離子損失掉一個單糖分子，結合Na- Na Liang[15]報道的葡萄皮中的化合物推測該化合物為：quercetin- 3-O- galactoside，分子式為C21H22O12，結構式如圖2所示。

表1 葡萄藤中化合物的精確分子量及二級質譜碎片信息

化合物5的精確分子量為301.008 0，結合En[16]、Eduardo[17]報道的文章推測該化合物可能為槲皮素，二級質譜裂解碎片離子與Li[18]報道的槲皮素的電噴霧離子阱質譜分析中槲皮素在負離子模式下的裂解途徑與碎片相似，由此可以推測該化合物為槲皮素，分子式為C15H10O7，結構式如圖2所示。

化合物6的母離子精確分子量為477.068 3，該化合物的碎片離子中含有[M- H]-=301.032 1，與Lambert等通過UPLC- QqQ- MS檢測到的化合物petunidin- 3-O-β- glucopyranoside相似[19]，推測該化合物為petunidin- 3-O-β- glucopyranoside，分子式為C22H23O12，結構式圖2所示。

化合物8的母離子精確分子量為227.071 8，與反式白藜蘆醇的精確分子量接近，且該化合物的離子碎片185.060 9與母離子相差42.010 9，推測出該裂解過程中失去1個C2H2O分子，同時碎片離子185.060 9，與碎片離子143.048 9之間也相差42.012 0，由此可見在該裂解過程中也失去一分子C2H2O。其裂解規律與Liu[20]報道的白藜蘆醇質譜裂解規律相同，因此該化合物為反式白藜蘆醇，分子式為C14H12O3，結構式如圖2所示。

化合物9母離子精確分子量為453.130 1，與白藜蘆醇母離子227.071 8相差226.062 1，并且在其離子碎片中含有225.050 6、119.047 4與化合物8中相同分子量的碎片，由此推斷此化合物為化合物8的二聚體，并且在此聚合過程中失去兩個氫。該化合物的碎片離子與Hurtado- Gaitán[21]采用UPLC- QQQ檢測到的ε- 葡萄素的離子碎片信息相似，同時與Yin等[22]報道的白藜蘆醇二聚體異構選擇機理中ε- 葡萄素的離子碎片信息相似，因此，推測該化合物為ε- 葡萄素，分子式為C28H22O6，結構式如圖2所示。

化合物7的母離子精確分子量為469.134 9，與化合物9的精確分子量相比相差16.004 8，推測可能是該化合物上的一個H被羥基取代，其次在其離子碎片中含有451.116 3、375.091 3等離子碎片，與Jia Yu等報道的trans- scirpusin A的離子碎片相似[23]，由此推測該化合物為trans- scirpusin A，分子式為C28H22O7，結構式如圖2所示。

化合物10與化合物11母離子分子量之間相差226.072 3，化合物11與化合物9母離子分子量之間相差226.059 2， 而化合物化合物9與化合物8的母離子分子量也相差226.054 4，這個規律正好與化合物9與化合物8之間的相同，因此推測化合物11是白藜蘆醇的三聚體，而化合物10則是白藜蘆醇的四聚體，在此過程中發現白藜蘆醇聚合物聚合時相鄰兩個聚合物之間相差226，而白藜蘆醇分子量為228.071 8，也就意味著每聚合一個白藜蘆醇分子就會失去兩個氫。化合物10的離子碎片與Sáez等[24]報道的vitisin B的離子碎片相似，由此推測化合物10為vitisin B，分子式為C56H42O12，結構式如圖2(10)所示；化合物11則與Keylor等[25]報道的白藜蘆醇三聚體miyabenol C合成過程中的離子碎片相似，因此推測化合物11為miyabenol C，分子式為C42H32O9，結構式如圖2所示。

圖2 通過UPLC- MS- Q- TOF結果推測出的化合物結構Fig.2 The structures of the compounds inferred from UPLC- MS- Q- TOF results注：1.反式咖啡酸；2.兒茶素；3.槲皮素- 3- O- 半乳糖苷；4.表兒茶素；5.槲皮素；6.矮牽牛素- 3- O- β- 吡喃葡萄糖苷7.反式三菱素A；8.反式白藜蘆醇；9.ε- 葡萄素；10.葡萄素B；11.還領多酚。Note:1.Trans- caftaric;2.Catechin;3.Quercetin- 3- O- galactoside;4.Epicatechin;5.Quercetin;6.Petunidin- 3- O- β- glucopyranoside;7.Trans- scirpusin A;8.Trans- resveratrol;9.ε- Viniferin;10.Vitisin B;11.Miyabenol C.

2.2 化合物變化規律及機制

通過HPLC對放置第0、2、5、10、15、20、48、80天的樣品進行含量檢測，結果如圖3所示，在整個放置過程中發現8個化合物的含量發生明顯變化。結合圖1中化合物的保留時間分析，這8個化合物分別為反式咖啡酸(trans- caftaric acid)、兒茶素(catechin)、表兒茶素(epicatechin)、槲皮素(quercetin)、反式白藜蘆醇(trans- resveratrol)、ε- 葡萄素(ε- viniferin)、葡萄素B(vitisin B)、還齡多酚(miyabenol C)。對于這8個化合物，通過計算單位質量葡萄藤(干重)各化合物對應的液相色譜圖中的峰面積(S)來表示其相對含量，其中橫坐標表示葡萄藤放置時間(天)，縱坐標表示化合物相對含量(S/g)，繪制各化合物含量隨放置時間變化趨勢圖，結果如圖4和5所示。

3 討論

結果發現葡萄藤中8個化合物的含量隨放置時間發生了明顯變化，但變化規律不盡相同，變化規律可分為兩種類型，第一類為反式咖啡酸、兒茶素、表兒茶素、槲皮素4 種化合物，其中反式咖啡酸屬于苯丙素類化合物，后三種屬于黃酮類化合物。4 種化合物含量隨放置時間的增加都呈下降趨勢，結果如圖4所示；第二類為反式白藜蘆醇、ε- 葡萄素、葡萄素 B、還齡多酚4 種化合物，這4 種化合物均屬于芪類化合物，為白藜蘆醇及其低聚物，其含量變化規律為在放置前期，化合物含量顯著上升，達到一定時期后含量開始下降，變化規律如圖5所示。

圖3 葡萄藤放置不同天數時其中化合物的變化情況Fig.3 Changes of compounds in grapevines during different days of storage

圖4 葡萄藤放置過程中trans- caftaaric acid、catechin、epicatechin、quercetin含量變化趨勢圖Fig.4 Trends of trans- caffeic acid,catechin,epicatechin and quercetin contents in grapevine during storage

在第一種現象中，反式咖啡酸含量隨放置時間的增加呈下降趨勢，反式咖啡酸屬于苯丙素類化合物，是葡萄植株中黃酮類化合物與芪類化合物的生物合成途徑中的合成前體物質，黃酮類化合物與芪類化合物生源合成途徑如圖6所示[26]。葡萄藤的采收后，在一定時間內相當于對其造成機械損傷及生理干旱，都屬于逆境脅迫過程，此時植物體內大量合成植物抗毒素來抵御逆境，而芪類化合物就屬于植物抗毒素之一，因此葡萄藤中啟動了芪類化合物的合成。反式咖啡酸作為芪類化合物的合成前體物質被大量消耗，導致反式咖啡酸含量急劇降低。在生源合成途徑中，tetraketide intermediate是葡萄植株中黃酮類化合物和芪類化合物生源合成的共同底物，當調控底物的合成基因為chalcone synthase(CHS)時合成黃酮類化合物，當調控底物的合成基因為stilben synthase(STS)時合成芪類化合物[27]，并且CHS基因與STS基因之間存在競爭關系[28]。STS基因屬于抗逆基因，當葡萄藤在逆境脅迫下，調控芪類化合物合成的STS基因表達量上升，因此調控黃酮類化合物合成的CHS基因表達量下降，使得黃酮類化合物無法繼續合成，葡萄藤中原有的黃酮類化合物(catechin、epicatechin、quercetin)發生自然降解導致含量下降，因此catechin、epicatechin、quercetin在放置過程中含量逐漸降低，到第15天左右時基本完全降解，結果如圖4所示。

圖5 葡萄藤放置過程中trans- resveratrol、ε- viniferin、vitisin B、miyabenol C的含量變化趨勢圖Fig.5 Trends of trans- resveratrol,ε- viniferin,vitisin B and miyabenol C contents in grapevine during storage

圖6 葡萄中黃酮化合物與芪類化合物合成途徑Fig.6 Synthetic pathways of flavonoids and stilbenes in grapes注：PAL：苯丙氨酸解氨酶；C4H：肉桂酸- 4- 羥基化酶；4CL：香豆酸輔酶A連接酶；CHS：查爾酮合酶；STS：二苯乙烯合酶。Note:PAL:phenylalanine ammonia- lyase;C4H:cinnamate 4- hydroxylase;4CL:4- coumarate;CHS:chalcone synthase;STS:stilben synthase.

對于第二種現象，在之前的研究中發現葡萄藤在放置過程中反式白藜蘆醇、ε- 葡萄素含量表現出先上升再下降的現象，并且反式白藜蘆醇、ε- 葡萄素在鮮樣中含量極低，但是在第二天這兩種化合物含量幾乎上升了十幾倍，白藜蘆醇作為一種植物抗毒素在植物處于逆境時會大量產生用于保護自身。在葡萄藤的采收后前20天內的放置過程相當于對其造成機械損傷及生理干旱，并且此時葡萄藤生命并未完全終止，因此體內抗逆基因表達量上升引起白藜蘆醇含量上升[29]；當放置到20天左右含量達到最高，分別約為鮮樣的250倍與190倍。在本次研究中發現含量變化與之相類似的還有葡萄素 B、還齡多酚兩種化合物，從結構上看這兩種化合物也屬于芪類化合物，都是以白藜蘆醇分子為基本單位的不同聚合體，分別為白藜蘆醇的三聚體和四聚體。兩種化合物作為白藜蘆醇的聚合體，在鮮樣中含量幾乎為零，如圖5所示，在放置第10天時葡萄素 B、還齡多酚含量開始上升，白藜蘆醇作為聚合體的合成底物，白藜蘆醇含量上升為聚合物合成提供充足的底物。此時反式白藜蘆醇、ε- 葡萄素在第10～15天期間含量上升速率不如前10天，由此可知從第10天開始反式白藜蘆醇、ε- 葡萄素正在聚合為葡萄素 B、還齡多酚。在葡萄藤放置20天后白藜蘆醇與ε- 葡萄素含量開始下降，在此期間葡萄藤生命還未完全終止，但是由于采收后的葡萄藤中合成白藜蘆醇的前體物質消耗殆盡，無法再繼續合成白藜蘆醇和葡萄素導致白藜蘆醇與ε- viniferin含量開始下降；而對于葡萄素 B、還齡多酚來說，此時葡萄藤中已經累積了大量白藜蘆醇與ε- 葡萄素，白藜蘆醇作為葡萄素 B、還齡多酚的聚合底物，在20天后仍可繼續合成聚合物，葡萄素 B、還齡多酚含量繼續上升，一直到50天左右后，此時的葡萄藤已經完全干枯，生命完全終止，因此葡萄素 B、還齡多酚的生物合成也已終止，葡萄素 B、還齡多酚含量開始下降。葡萄藤干枯后，各種化合物產生自然降解，由于物質的穩定性不同，每種化合物含量下降的速率也不盡相同，白藜蘆醇作為其它三種化合物的合成底物，所以后期降解速率最快直到完全消失。

夏黑葡萄藤在放置過程中，苯丙素類化合物(trans- caftaric acid)與黃酮類化合物(catechin、epicatechin、quercetin)在第二天或第五天含量略有起伏，推測應該為植物體的應激反應。對于葡萄藤放置一段時間后中其中芪類化合物含量顯著上升的現象，主要是由于在葡萄藤采收后20天左右枝蔓生命并未完全終止，在此期間枝蔓受到機械損傷和干旱的環境脅迫，刺激到調控植物抗毒素即芪類化合物合成的的基因表達量上升，以至于芪類化合物含量上升。實驗中發現白藜蘆醇的三聚體(vitisin B)和四聚體(miyabenol C)在新鮮材料中基本不存在，是在放置過程中產生的新化合物，這為vitisin B和miyabenol C開發利用提供了新的途徑。由于8個化合物的標準品不易制得，本研究沒有采用標準品進行各化合物定量分析，在后續研究中將繼續進行標準品的制備和絕對定量分析，同時將進行葡萄藤枝蔓放置過程中蛋白和芪類化合物關鍵控制基因的表達分析，進一步確定各類化合物的轉化機制。

葡萄藤是葡萄酒工業及葡萄鮮食產業的廢棄物，常規處理(焚燒堆肥)往往會造成資源浪費、利用率低下，葡萄藤中含有多種活性成分，活性成分種類及含量與葡萄的品種有關，白藜蘆醇是葡萄植株中的一種特征化合物，具有較高的利用價值，通過將廢棄的葡萄藤枝蔓放置后會引起白藜蘆醇及其低聚物含量升高，達到開發利用其活性成分的目的，是一種理想的生物綜合利用方式。

本研究采用UPLC- Q- TOF- MS及HPLC兩種現代分析方法從化學成分含量變化規律的角度，以白藜蘆醇為考察重點，結合白藜蘆醇的生源合成途徑，揭示了葡萄藤剪枝放置過程中芪類化合物的變化規律和變化機制，為廢棄葡萄藤枝蔓綜合利用提供了理論依據。