黃芪- 蒼術改善糖尿病腎病糖脂代謝的網絡藥理學研究

王 鑫，吳巧敏，黃超穎，王箴儀，施 敏，周逸鈞，張美芳，陳潔文

上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院臨床營養科，上海201900

流行病學調查顯示，2013年中國18歲以上成年人的糖尿病患病率為10.4%，患病人數位居全球首位[1]。糖尿病腎病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病最主要的微血管并發癥之一，也是導致終末期腎病的主要原因之一[2]，近年來我國DKD的患病率也呈增長趨勢。DKD早期發病隱匿，難以及時發現，發展至臨床后期通常難以逆轉，最終需接受透析或腎移植治療，嚴重影響患者生活質量，因此對DKD進行早期干預治療具有重要意義[3]。但DKD的發病機制目前尚不完全清楚，研究認為其可能與高血糖引起的氧化應激、糖脂代謝紊亂、細胞因子表達異常、腎組織炎癥反應增加、腎臟血流動力學變化等有關[4,5]。DKD臨床診斷為：糖尿病引起的慢性腎臟病，主要包括腎小球濾過率(GFR)低于60 mL/min/1.73 m2或尿白蛋白/肌酐比值(ACR)高于30 mg/g持續超過3個月[6]。西醫治療DKD主要關注控制血糖、血壓、血脂、改善尿蛋白等方面，但這并不能完全阻斷DKD的發生發展。

中醫認為DKD屬于“消渴”、“水腫”、“虛勞”等范疇，臨床證型為脾腎兩虛、濕瘀互阻型[7]。近年來，中醫藥在防治DKD發生發展、延緩腎功能等方面顯示出較大的優勢。中藥具有抗氧化、調節免疫、降脂降糖等多種藥理學特性。黃芪及其成分改善腎臟疾病的機制可能是通過抗過氧化作用、調節內皮素、改善血小板功能、調節糖代謝。研究表明，黃芪通過下調腎組織脂聯素表達降低糖尿病腎病大鼠血糖和減少尿蛋白[8]。黃芪甲苷可能通過抑制內質網應激及影響TGF-β/SMADS信號通路發揮改善糖尿病腎病作用[9]。蒼術具有抑制糖原生成、抗缺氧、抗炎、調節糖脂代謝等作用[10]。研究表明，蒼術多糖對STZ誘導大鼠的血糖、血脂具有調節作用，主要通過抑制糖類消化酶活性，降低腸道糖類吸收[11]。研究發現，芪術顆粒(主要成分為黃芪、蒼術)可通過回調DKD糖代謝、脂代謝及氨基酸代謝等過程中的代謝中間產物顯著改善DKD糖脂代謝紊亂、尿蛋白水平，保護腎臟功能，延緩病情進展[12,13]。鑒于中藥具有多成分、多靶點等特點，目前黃芪- 蒼術改善DKD糖脂代謝的分子作用機制尚未完全闡明。

網絡藥理學(network pharmacology)是由英國藥理學家Hopkins在2007年提出，基于系統生物學理論，運用各種組學、高通量篩選、網絡分析等技術揭示“藥物- 靶點- 疾病”間的復雜網絡關系，打破既往單成分- 單靶點- 單疾病的研究模式，對預測中藥多成分、多靶點、多途徑的作用機制具有重要意義[14]。因此，本研究從網絡藥理學出發，對黃芪- 蒼術改善糖尿病腎病糖脂代謝的有效成分、作用靶點及信號通路進行探索，根據GO和KEGG信號通路富集分析其潛在作用機制，為進一步實驗及臨床研究提供理論依據。

1 方法

1.1 黃芪- 蒼術活性成分篩選

以黃芪、蒼術作為研究對象，依托中藥系統藥理學數據庫及分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)分別篩選出與黃芪、蒼術相關的所有化學成分，排除其中相同的化學成分[15]。口服生物利用度(oral bioavailability，OB)是藥物吸收、分布、代謝、排泄中最重要的藥動學參數之一，表示口服藥物的有效活性成分被吸收后到達體循環的速度和程度。OB值表示活性成分的類藥性(drug- likeness，DL)，值越高表明類藥性越好。參考文獻報道，根據藥代動力學參數確定以OB≥30%，DL≥0.18作為化合物有效活性成分的篩選條件[16]。

1.2 黃芪- 蒼術活性成分靶點預測及構建“活性成分- 靶點”網絡圖

根據TCMSP平臺篩選出的化學成分，以及候選化學成分的蛋白質潛在靶點。用Uniprot數據庫(http://www.uniprot.org/)中的Uniprot KB搜索功能，輸入靶點名稱并設定物種為人，將檢索到的所有蛋白靶點得到相應的基因名稱(official symbol)[17]。再采用網絡圖像化軟件Cytoscape 3.6.1(http://www.cytoscape.org/)構建“活性成分- 靶點”網絡圖。網絡中節點(node)表示活性成分和基因靶點。若某一活性成分作用于該靶點，則以邊(edge)相連。

1.3 糖尿病腎病相關靶點檢索

本研究通過將“diabetic nephropathy”、“nephropathy，diabetic”、“diabetic kidney disease”作為檢索詞在人類基因組數據庫GeneCards(http://www.genecards.org/)、TTD(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)、DrugBank(https://www.drugbank.ca/)、OMIM(http://www.omim.org/)等公認的疾病靶點數據庫進行檢索，獲得目前已報道的與DKD相關的靶點。將藥物活性成分對應的靶點與疾病相關靶點取交集。

1.4 蛋白質- 蛋白質相互作用網絡圖及藥物活性成分- 靶點- 疾病網絡圖構建

運用STRING(https://string- db.org/)和Metascape(http://metascape.org/)數據庫，導入上述取交集的靶點，設定物種為人，進行蛋白相互作用分析，構建蛋白質- 蛋白質相互作用關系(protein- protein interaction，PPI)網絡圖。

1.5 Pathway富集分析

通過DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)富集分析上述獲得的關鍵靶點，人種設定為人，富集分析GO(gene ontology)生物學過程(生物過程、分子功能、細胞組成)和KEGG(KEGG pathway analysis)信號通路，總結研究黃芪- 蒼術改善糖尿病腎病糖脂代謝相關信號通路。

2 結果

2.1 篩選黃芪- 蒼術的有效活性成分

截至2019年4月，通過查找中藥化學成分數據庫及相關文獻，共收集到黃芪的化學成分87種，蒼術的化學成分49種，匯總去掉重復化學成分，共有136種，其中同時滿足OB≥30%和DL≥0.18的化學成分共有29個(見表1)。

表1 黃芪和蒼術的有效活性成分

2.2 黃芪- 蒼術作用靶點預測及“活性成分- 靶點”網絡構建分析

在TCMSP數據庫中篩選出黃芪活性成分的潛在靶點446個，刪除重復靶點后剩余213個；篩選出蒼術活性成分的潛在靶點66個，刪除重復靶點后剩余57個。兩者匯總刪除重復后剩余218個靶點。利用Cytoscape軟件構建活性成分- 靶點網絡(如圖1)，該網絡中有506條邊，代表活性成分和靶點的相互作用關系，有9個化合物無對應靶點。其中，槲皮素(quercetin)有最多的潛在靶點共154個，其次為山奈酚(kaempferol)有63個潛在靶點。其它如漢黃芩素(wogonin)、異鼠李素(isorhamnetin)、常春藤皂甙元(hederagenin)、芒柄花素(formononetin)對應靶點也較多，分別為22、37、24、15個。

圖1 黃芪和蒼術有效活性成分- 靶點圖Fig.1 Active component- target network between S.membranaceus and A.lancea注：圓圈：靶基因；菱形：化合物。Note:Circle:target gene;Diamond:compound.

2.3 DKD相關潛在靶點預測

通過檢索TCMSP、Drugbank、TTD、OMIM、GeneCards等數據庫，共獲得目前與DKD發生發展密切相關的靶點基因1 412個，將其與活性成分對應靶點取交集，共得到97個靶點。表明這97個靶點可能是黃芪- 蒼術治療DKD的關鍵靶點。

2.4 黃芪和蒼術活性成分對應潛在靶點網絡圖

根據STRING和Metascape分析得出，黃芪和蒼術活性成分對應潛在靶點之間的PPI網絡圖主要為絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、轉化生長因子(TGFB1)、表皮生長因子(EGFR)、胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBP3)等相互作用(如圖2和圖3)。

圖2 黃芪和蒼術活性成分對應靶點的PPI網絡圖(STRING數據庫)Fig.2 PPI network of target proteins in S.membranaceus and A.lancea from STRING database

圖3 黃芪和蒼術活性成分對應靶點的PPI網絡圖(Metascape數據庫)Fig.3 PPI network of target proteins in S.membranaceus and A.lancea from Metascape database

2.5 黃芪- 蒼術改善DKD糖脂代謝信號通路富集分析

運用DAVID數據庫，對上述黃芪和蒼術活性成分對應的97個基因靶點進行分析，GO功能分析得到1 220個條目，其中1 069個具有統計學意義(P<0.05)，其中生物過程(BP)條目944個，主要涉及細胞增殖的調節、凋亡、程序性細胞死亡、對內源性刺激的反應、分子功能的正向調節、對類固醇激素刺激的反應等生物學過程；分子功能(CC)條目60個，主要涉及細胞外空間、胞質、膜筏等；細胞組成(MF)65個，主要涉及蛋白質結合、蛋白質二聚化活性、類固醇激素受體活性、細胞因子活性、配體依賴性核受體活性、蛋白激酶調節活性等方面，見圖4。

KEGG富集分析篩選到58條通路，其中55條具有顯著意義(P<0.05)，其中有關糖脂代謝通路有11條，主要涉及mTOR信號通路、胰島素信號通路、脂肪細胞因子信號通路、Jak- STAT信號通路、糖尿病信號通路等(見圖5)。

圖4 黃芪- 蒼術治療DKD潛在靶點的生物學功能分析Fig.4 GO enrichment analysis of potential target of S.membranaceus and A.lancea for the treatment of diabetic kidney disease注：A:生物過程；B：細胞組分；C：分子功能。Note:A：biological process;B：cellular component;C:molecular function.

圖5 黃芪- 蒼術改善DKD糖脂代謝相關信號通路的KEGG分析Fig.5 KEGG analysis of potential target of S.membranaceus and A.lanceafor the treatment of glucose and lipid metabolism in diabetic kidney disease

3 討論

本次研究的目的是，通過網絡藥理學方法分析黃芪- 蒼術改善糖尿病腎病糖脂代謝的有效活性成分、作用靶點及相關信號通路，探討其中可能的作用機制，結果發現黃芪- 蒼術可能是通過mTOR信號通路、胰島素信號通路、脂肪細胞因子信號通路、Jak- STAT信號通路、糖尿病信號通路等多條信號通路發揮改善DKD糖脂代謝的作用。研究結果顯示，黃芪和蒼術的有效活性成分為29個，預測出對應的潛在作用靶點218個。活性成分- 靶點網絡分析結果顯示，槲皮素和山奈酚的靶點最多，還有漢黃芩素、異鼠李素、常春藤皂甙元、芒柄花素等對應的靶點也較多，活性成分對應靶點主要有PIK3CG、AKT1、MAPK1、IGF2等。提示這幾種成分很可能是黃芪- 蒼術發揮作用的主要成分。以往研究表明，槲皮素和山奈酚都具有廣泛的藥理學作用，槲皮素有抗氧化、降血糖、降血脂、抑制腫瘤、抗炎等作用[18]。還有研究認為，槲皮素對DKD具有保護作用，可延緩糖尿病患者腎小球硬化的進程，通過降低TGFβ1/Smad表達抑制高糖引起的腎小球系膜細胞增殖[19]。山奈酚具有抗炎、抗凋亡、抗氧化等多種生物學活性[20]。一項研究顯示，山奈酚通過調控p38- MAPK信號通路抑制高糖刺激下大鼠腎系膜細胞增值[21]。這充分表明藥物與靶點的復雜網絡關系，驗證了黃芪- 蒼術是以多成分、多靶點的方式發揮改善DKD的作用。

本研究GO富集分析結果顯示，黃芪- 蒼術中的有效活性成分廣泛涉及細胞增殖的調節、凋亡、程序性細胞死亡、對內源性刺激的反應、分子功能的正向調節、對類固醇激素刺激的反應、蛋白質結合、蛋白質二聚化活性、類固醇激素受體活性、細胞因子活性、配體依賴性核受體活性、蛋白激酶調節活性等多種生物學過程。KEGG富集分析顯示，黃芪- 蒼術改善DKD糖脂代謝通路有11條，主要涉及mTOR信號通路、胰島素信號通路、糖尿病信號通路、脂肪細胞因子信號通路、Jak- STAT信號通路、MAPK信號通路等。這一結果提示黃芪- 蒼術具有多靶點- 多通路改善DKD糖脂代謝的重要作用。目前研究認為DKD發病機制主要涉及糖脂代謝改變、氧化應激、胰島素抵抗、細胞凋亡、炎癥等方面。研究發現，高糖環境下產生糖基化終產物激活PKC、NF- κB、MAPK、Jak- STAT等信號通路，促進細胞外基質合成及沉積[22,23]。這些證據表明mTOR信號通路、胰島素信號通路、Jak- STAT信號通路等在DKD發生發展中發揮重要作用，與本研究的研究結果一致，同時也表明，疾病的調控機制存在復雜且相互交叉的關系。

綜上所述，本研究應用網絡藥理學方法，從理論上初步分析了黃芪- 蒼術改善DKD糖脂代謝的主要活性成分及可能機制，探討了黃芪- 蒼術對DKD相關信號通路的作用，為進一步實驗及臨床研究探討黃芪- 蒼術的確切機制提供線索。對黃芪- 蒼術改善DKD糖脂代謝的復雜分子網絡關系進行研究，體現中藥多成分、多靶點、協同作用的特點，也為今后研究中藥復方改善DKD的分子作用機制提供依據。