反義寡核苷酸在中樞神經系統退行性疾病中的作用研究進展

孫姜瑾，李 鳴，劉亞奇綜述，楊 薇審校

中樞神經系統退行性疾病(central nervous system degenerative disorders)是一組原因不明的慢性進行性損害中樞神經系統的疾病總稱，主要包括帕金森病(Parkinson’s disease,PD)、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、亨廷頓病(Huntington disease，HD)、肌萎縮側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)等，大多是神經組織在衍化、發育、成熟、衰老等過程中在分子生物學水平上發生一系列復雜變化。神經系統退行性疾病是一類由環境與遺傳等多種因素共同影響的疾病，其主要特征在于一些特定的蛋白錯誤折疊并聚集于細胞中導致神經元變性、壞死[1]。PD、AD、HD和ALS等可見中樞神經系統異常RNA和蛋白質的聚集[2～6]。消除異常聚集RNA的毒性和錯誤蛋白的折疊，已經被證實能夠改善退行性癥狀[7]。但是，部分非特異性靶向蛋白治療因同時損害了正常非突變蛋白的功能，在改善退行性癥狀的同時，可能伴有正常生理功能的缺失[8]。目前，除了有臨床批準的可延緩帕金森病病情進展的治療方案外，此類疾病仍然缺少有效的控制手段。

反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides，ASOs)是一類可與特定的RNA通過堿基互補配對原理結合，從而引起基因轉錄或者翻譯改變的單鏈核苷酸。ASOs能夠精準作用于靶向基因轉錄產物，并且ASOs能夠透過血腦屏障，作用于中樞神經系統[9,10]。ASOs在動物和人體試驗中取得了良好的結果。在動物試驗中，ASOs可靶向突變基因，減少突變基因異常擴增或者錯誤轉錄翻譯導致的聚集性RNA和蛋白質毒性[5,6,10～14]。在人體試驗中的臨床試驗Ⅰ～Ⅱ期結果表明，一定劑量范圍內的ASOs可在減少HD和ALS突變蛋白表達的同時，沒有表現出嚴重的不良反應[15,16]。

ASOs可調控轉錄RNA和翻譯蛋白質的穩態，在分子水平干預錯誤蛋白的發生以及聚集，減輕疾病的病理性進展程度。ASOs具有的這些特性為神經系統退行性疾病的治療提供了理論基礎[5,6,10～14,17]。動物和人體試驗為ASOs的臨床應用提供了實踐的積累[4～6,13,15,16,18]。本綜述主要總結ASOs治療中樞神經系統退行性疾病的研究進展。

1 ASOs治療帕金森病研究進展

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一種以黑質多巴胺神經元變性死亡為主要特征的神經系統退行性疾病。臨床上主要表現為靜止性震顫、運動遲緩、肌強直及姿勢平衡障礙。人群特征方面，男性帕金森病發病率高于女性。雖然環境因素與帕金森病關系密切，單基因或基因組學研究表明，編碼α-突觸核蛋白和Leucine-rich repeat kinase 2的SNCA和LRRK2基因的突變，會導致蛋白異常聚集和蛋白轉運障礙。病理特征方面，帕金森病個體內殘存的神經元胞漿內可出現以α-突觸核蛋白為主要成分的嗜酸性包涵體。遺傳性帕金森病最常見的突變是LRRK2，而α-突觸核蛋白異常聚集和沉積是影響PD發病以及進展的關鍵步驟[19]。因此，調控異常蛋白的轉錄和翻譯水平，能夠減少甚至逆轉異常蛋白的聚集，恢復相應蛋白的功能。

ASOs可誘導性地調控靶向目的基因的轉錄，從而調控蛋白的表達和功能。在帕金森病的ASOs治療中，針對LRRK2和α-突觸核蛋白的研究已經取得了初步的成果。ASOs能夠誘導過表達的α-突觸核蛋白在一定范圍的下調，既能減輕因α-突觸核蛋白表達異常帶來的毒性作用，又不會因α-突觸核蛋白功能缺失導致的生理活動障礙。同時ASOs可選擇性地調控LRRK2激酶活性，從而調節線粒體功能、自噬，甚至可與α-突觸核蛋白協同作用，減少帕金森病的病理學改變[20,21]。

Alarcan-Aris等[20]人將siRNA、ASOs與單胺再攝取抑制劑偶聯的分子經鼻腔內給藥后可選擇性地降低小鼠中腦黑質致密區、腹側被蓋區、背側縫核和藍斑單胺核團中的α-突觸核蛋白表達。選擇性地α-突觸核蛋白敲低20%～40%能夠增強前腦多巴胺和五羥色胺的釋放，并且不引起單胺神經元的退行性病變。總之，通過鼻內給藥可獲得的細胞選擇性和功效表明，ASOs可能是減少單胺類神經元中α-突觸核蛋白表達的新方法，在帕金森病治療中具有很大的發展潛力[20]。

此外，LRRK2的顯性遺傳突變是家族性和散發性PD最常見的遺傳病因。Zhao等[21]發現ASOs介導的LRRK2抑制可預防小鼠體內病理性α-突觸核蛋白的形成，并且可以減輕多巴胺能神經元丟失的程度，改善α-突觸核蛋白介導的運動缺陷。與普通LRRK2激酶抑制劑不同，在治療劑量大致相同情況下，顱內注射ASOs不會影響外周器官(例如腎臟、肺臟)中LRRK2的水平，避免與LRRK2抑制相關的周圍組織的潛在副作用[21]。表明ASOs介導的LRRK2抑制可能是治療PD的潛在療法。

同時，由于帕金森病發病率的性別差異，Lee等[22]發現性別決定相關基因(SRY)參與調節雄性大鼠黑質多巴胺能的合成。ASO調控的選擇性SRY表達下降會削弱帕金森大鼠的運動障礙和多巴胺能神經元的丟失。ASO的良性作用在于其能減少雄性相關性的DNA損傷、線粒體老化和神經免疫異常。并且，SRY特異性ASO能減小甚至消除帕金森模型大鼠在黑質紋狀體結構功能、DNA損傷和神經免疫的性別差異[22]。

綜上所述，目前的研究表明，針對帕金森病的ASOs已經在臨床前取得了一些成果。其作用機制主要在于調控α-突觸核蛋白和LRRK2基因的表達，降低異常蛋白毒性，并且盡量保留未病變蛋白的生理活性[20,21]。同時，選擇性調低性別決定基因，或許能夠降低男性的帕金森病發病風險[22]。

2 ASOs治療AD研究進展

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是最常見的癡呆類型。其主要表現為發作性記憶和認知功能的逐步喪失，以及語言和視覺空間能力不足，并常常伴隨著行為障礙，例如冷漠，攻擊性和沮喪等。其組織病理學表現為細胞外以β-淀粉樣蛋白(amyloid-β，Aβ)沉積為核心的神經炎性斑(neuritic plaque，NP)、細胞內以高度磷酸化的tau蛋白螺旋化為主的神經原纖維纏結(neurofibrillary tangle，NFT)和神經元缺失以及膠質增生[3]。其中，Aβ的生成與清除失衡及高磷酸化的tau蛋白是發病的主要原因。在世界人口老齡化的背景下，阿爾茨海默患者的發病率和患病率持續增加，并且已經成為了影響居民健康和生存時間的前位危險疾病[3]。因此，尋求一種有效的治療方法已經迫在眉睫，而ASOs因其可定位并且定量的特點，在阿爾茨海默病的臨床前試驗中取得了一定的成效。

Aβ生成與清除障礙是Aβ沉積并且發揮毒性的基礎，也是導致認知功能下降的病理學基礎。因此靶向Aβ一直是尋求治療AD的重要方法。Aβ是由淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)剪切產生。Chang等[9]證明了一種選擇性不表達剪接Aβ所需的蛋白水解位點的可變剪接反義寡核苷酸(SSOs)，可使表達的APP蛋白缺少水解Aβ所需的蛋白水解必須片段，從而廣泛減少小鼠顱內Aβ的產生。此實驗中的SSOs有2’-O-甲氧基乙基核糖核苷酸和硫代磷酸酯修飾的骨架，為水溶性，對核酸外切酶具有對抗性，并且可高度擴散。可以通過腦室內注射至大腦，從而靶向目標細胞。以這種方式提供的SSOs具有廣泛的分布和吸收能力及有效的作用時長。Aβ除了生成過程的異常外，還可能存在清除障礙。同時，PSEN1基因的突變，是早發型阿爾茨海默最常見的致病因素。PSEN1編碼的早老素蛋白是γ-分泌素的主要組成成分。PSEN1的突變可能會增加Aβ的異常生成與沉積。Fiorini等[10]發現，在應用針對PSEN1的ASO之后，可導致SAMP8體內的氧化應激產物減少，并且能夠逆轉衰老小鼠學習和記憶功能的下降。此實驗證明了使用ASOs干預Aβ的表達是治療AD的潛在方法。

tau蛋白是由17號染色體上的微管相關蛋白tau基因(MAPT)編碼。ASO可選擇性降低人源MAPT 突變小鼠的tau蛋白水平，并且能夠預防神經元的丟失和逆轉病理性tau蛋白的聚集和沉積[4]。鞘內注射ASOs后，P301S tau突變小鼠表現出tau沉積的形成減少、現有tau病理結構得到逆轉、以及海馬神經變性的減少。鞘內注射后，tau ASOs也會分布于食蟹猴的整個大腦和脊髓，并同時伴有腦和脊髓液中的tau mRNA和蛋白質水平的下降[4]。Tau 特異性的ASOs在小鼠和非人類靈長動物的成功或許能夠為ASOs在阿爾茨海默的成功奠定堅實的基礎。

阿爾茨海默病也有相當程度的代謝改變，并且代謝相關基因的突變也在疾病的發生發展過程中起到重要作用。糖原合酶激酶3β(GSK-3β)與tau蛋白的磷酸化密切相關，GSK-3β的異常參與阿爾茨海默病的進展。Farr等[12]發現針對GSK-3β特異磷酸化修飾位點的ASO可緩解SAMP8(非轉基因)和Tg2576(APPswe，轉基因)小鼠學習和記憶的缺失。Apolipoprotein E(APOE)是一種與脂質代謝相關的蛋白，APOE-ε4突變是晚發型阿爾茨海默病危險因素。直接作用于APOE或者其受體的ASOs已經成功逆轉或者緩解阿爾茨海默小鼠模型的病理學改變，同時可伴有認知功能的改善[13,14]。雖然ApoER2(APOE受體2)的功能并不明確，但Hinrich的研究表明，ASO可通過選擇性剪接ApoER2外顯子來更正受體功能。腦室內單次ASO誘導的外顯子可變剪接能夠提高小鼠的突觸功能和學習記憶長達半年之久[13]。而直接針對APOE的ASOs研究表示，對于APP/PS1-21小鼠中，ASOs起始作用時Aβ的病理狀態，影響了ASOs的效能。Huynh的研究表明，在Aβ病理性斑塊沉積前應用ASOs能夠極大地減少Aβ的病理毒性。然后在Aβ沉積后應用ASOs可能會增加Aβ斑塊的大小和毒性[14]。因此，ASOs作用于代謝相關的基因，也可能會影響Aβ和tau的病理變化。

阿爾茨海默病主要的病理基礎是Aβ的生成與清除障礙和tau蛋白異常磷酸化導致的異常蛋白沉積。因此，目前旨在緩解阿爾茨海默病的ASOs主要靶點是在減少異常Aβ和tau蛋白的產生，同時減輕異常蛋白沉積導致的毒性作用[4,9,10]。除此之外，作用于代謝相關的酶或者配體受體同樣可能會對幾種神經系統退行性病作用[12～14]。雖然針對阿爾茨海默病的ASOs揭示臨床試驗結果，但從目前的情況看，動物試驗能夠緩解阿爾茨海默的癥狀。

3 ASOs治療HD研究進展

亨廷頓病(Huntington disease，HD)是一種常染色體顯性遺傳的神經系統退行性疾病。臨床上以運動障礙、認知障礙和精神異常為特點。目前認為本病是由(Huntingtin，HTT)異常擴增的CAG重復序列所引起，這導致翻譯過程中產生了亨廷頓蛋白突變體(mutant Huntingtin，mHTT)。因此，在分子水平上減少HTT基因的轉錄和翻譯，從而限制突變型HTT產生下游的毒性效應，有助于減緩、阻止或逆轉HD病理和癥狀的進展。值得鼓舞的是，臨床前試驗的結果表明ASOs可靶向調控HTT基因的RNA轉錄，降低mHTT的毒性，并且臨床試驗初級階段也證實ASOs應用于亨廷頓患者有效性和耐受性[6,11,16]。

目前正在探究兩種不同的ASOs治療策略：使野生型和突變型都減少的亨廷頓蛋白非選擇性治療及以異常擴增的CAG重復序列為靶點的選擇性治療。等位基因非選擇性治療的優勢在于該方法可用于所有HD患者，而等位基因選擇性治療僅適用于一部分HD患者，因而需要多種等位基因選擇性藥物來治療整個HD人群。但是等位基因非選擇性治療會在降低突變亨廷頓蛋白的同時，會導致正常亨廷頓蛋白的下降，從而引起亨廷頓蛋白缺失導致的生理功能缺損。考慮到非選擇性地剔除亨廷頓蛋白會造成嚴重的不良反應，目前測試ASOs對亨廷頓疾病的試驗都是選擇性針對mHTT的[6,7,11,16,23]。

等位基因選擇性ASOs沉默mHTT在臨床前實驗動物體內及體外取得了初步的療效。正常亨廷頓基因CAG重復擴增的次數一般不超過35個，而mHTT的CAG重復擴增次數多于40個。Ostergaard等[23]通過將ASOs特異識別與mHTT異常重復擴增相關的單核苷酸多態性的位點結合，并沉默這些位點，選擇性抑制了mHTT的mRNA及蛋白水平。等位基因選擇性ASOs的注射，改善了小鼠的認知和行為學缺陷，并且在小鼠和食蟹猴或恒河猴中樞性應用ASOs后，mHTT水平的降低，廣泛見于調節認知和情緒控制的中樞[6,7]。而且，將特異性識別mHTT的ASOs注射到正常小鼠的中樞神經系統內，并沒有引起明顯的不良反應，也說明了等位基因選擇性ASOs的有效性和良好的耐受性[23]。再者，與完全HTT敲除的小鼠相比，ASOs不僅延緩了疾病的進展，而且有些逆轉的病理表現持續時間更長[6]。

同時，選擇性針對mHTT水解后的片段產物也取得了良好的成果。相比于完整的亨廷頓蛋白，氨基端的亨廷頓蛋白片段具有更強的毒性。重要的氨基端水解片段是亨廷頓蛋白的外顯子12表達，因此選擇性沉默外顯子12的表達可能會抑制亨廷頓蛋白的水解，從而降低突變蛋白的毒性。Evers等[11]發現紋狀體定位注射可造成外顯子12不表達的ASOs后，翻譯的亨廷頓蛋白的缺少了外顯子12的表達，缺少了被水解的標記，從而降低了突變亨廷頓蛋白的毒性。

鑒于ASOs在非人類動物治療HD的可能性，針對HD患者的ASOs臨床試驗也取得了初步的成果。IONIS-HTT Rx是第二代反義寡核苷酸，旨在降低HTT信使RNA(mRNA)的濃度。IONIS-HTT Rx通過Watson-Crick堿基互補配對與其同源mRNA結合，從而觸發RNase H1介導的靶mRNA降解[16]。Tabrizi等[16]的隨機雙盲Ⅰ～Ⅱ期試驗表明，在一定的濃度范圍內，突變亨廷頓蛋白的下降與鞘內注射的IONIS-HTT Rx劑量呈現出濃度依賴性。IONIS-HTT Rx可有效降低突變亨廷頓蛋白的濃度，并且沒有引起嚴重的不良反應。

亨廷頓病是一種由亨廷頓基因異常重復擴增導致的神經系統退行性疾病。亨廷頓基因的異常擴增既可能會導致病變基因轉錄正常RNA和翻譯正確蛋白質能力的減弱，也可能因異常翻譯的蛋白質產生病理性毒性。動物試驗和臨床試驗表明，等位基因選擇性ASOs兼具有效性和良好的耐受性[6,7,11,16,23]。

4 ASOs治療ALS研究進展

肌萎縮側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一種運動神經元病，主要表現為肌無力、肌萎縮及錐體束征。此病大多為散發，遺傳方式主要為常染色體顯性遺傳。已知有20余種基因可導致該疾病，最常見的致病基因是21號染色體上的銅(鋅)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase 1，SOD-1)及9號染色體上的C9ORF72基因。一個基于意大利ALS人群的研究發現，將近10%的ALS患者攜帶ALS相關基因突變。并且在這些突變中，C9ORF72與SOD-1是最常見的突變基因[18]。突變的SOD-1和C9ORF72可導致相關RNA和蛋白質穩態的失衡，促進了ALS的發生與發展。因此，針對突變SOD-1和C9ORF72的反義治療策略意義重大[5,24,25]。

SOD-1相關性突變是肌萎縮側索硬化最常見的遺傳危險因素之一[18]。目前認為SOD-1基因突變的致病機制并非是SOD-1功能缺陷，而是突變后SOD-1促氧化作用增強，同時由于錯誤折疊產生異常聚集進而對前角運動神經元產生毒性作用。考慮到SOD-1具有毒性的功能獲得作用，因此降低SOD-1的水平具有治療作用。Winer等[26]發現，將ASOs作用于表達人類SOD-1基因的小鼠，可有效降低腦組織SOD-1 mRNA和SOD-1蛋白水平的表達。此外，McCampbell[27]等人通過實驗研究發現降低SOD-1的ASOs可以顯著延緩疾病的發作，并延長模型動物的生存期。并且，腦脊液SOD-1水平與ASOs應用密切相關。臨床研究方面，Tofersen，一種靶向SOD-1的ASOs的Ⅰ～Ⅱ期試驗已經取得了初步的成果。在一定的劑量范圍內，Tofersen的劑量與腦脊液SOD-1下降的水平呈現一定的負相關性。而且，除了腰穿引起的不良反應和腦脊液細胞數增多外，沒有發現與Tofersen應用直接相關的嚴重不良反應[15]。

C9ORF72基因非編碼區GGGGCC六核苷酸重復序列的重復擴增是肌萎縮側索硬化最常見的突變類型[18]。異常重復擴增的六核苷酸序列能夠在核內外定位形成以RNA為主題的沉積物，消除RNA沉積物的影響會緩解因沉積物聚集導致的毒性作用。Lagier-Tourenne等[28]發現，特殊的ASOs在沒有明顯改變小鼠C9orf72 正常表達的情況下，減輕因核內RNA沉積物導致的毒性。同時期，來源于肌萎縮側索硬化患者的神經細胞在經ASOs處理后，核內因六核苷酸重復擴增形成的RNA沉積物也被抑制[29]。C9ORF72基因變異鏈上的六核苷酸重復擴增導致的異常RNA在核內聚集被證明是導致神經細胞退行的重要原因[5,27,29]。Jiang等[5]證明，腦室內定向注射靶向重復擴增C9ORF72的ASOs可有效在保證正常C9ORF72基因功能的情況下，降低攜帶突變C9ORF72轉基因小鼠的錯誤RNA和蛋白質的表達水平。并且能有效改善由C9ORF72突變導致的行為學障礙。這為在未來的臨床研究中靶向ALS中的C9ORF72建立了基礎。

由于肌萎縮側索硬化患者多數是散發型，很大一部分的患者并不具有特異性的基因突變，因此ASOs特異性靶向突變基因對肌萎縮側索硬化有很大的局限。TDP-43，一種轉錄相關蛋白的突變幾乎見于所有的肌萎縮側索硬化的患者中。Becker等[25]發現通過單劑ASOs特異性降低ataxin-2的表達可有效地降低TDP-43的無效聚積，同時極大地延緩了TDP-43小鼠的壽命。一種能廣泛作用于所有肌萎縮側索硬化的治療手段或許在未來會更加具有優勢。

綜上所述，ASOs在肌萎縮側索硬化動物試驗和臨床試驗中都取得了不錯的成效。在動物試驗中，ASOs可改善因SOD-1或C9ORF72基因突變導致的轉錄的RNA或翻譯的蛋白質毒性作用[5,26,28,29]。并且，臨床試驗顯示，靶向SOD-1的ASOs在臨床試驗早中期證明了治療的有效性和可耐受性[15]。同時，由于無遺傳特殊性肌萎縮側索硬化患者的普遍性，作用于更加肌萎縮側索硬化患者更加普遍的病理，或許更加具有優勢[25]。

5 總 結

中樞神經系統退行性疾病是一類以特異性神經元丟失為特征的不可逆轉性疾病，除帕金森病外，阿爾茨海默病、亨廷頓病和肌萎縮側索硬化缺少良好的藥物管理方式[2,19]。帕金森病、阿爾茨海默病、亨廷頓病和肌萎縮側索硬化所擁有的共性是有異常蛋白質或者RNA的聚積導致的神經元變性。因此，特異性作用于錯誤轉錄和翻譯這些RNA或蛋白質的基因是一個不錯的選擇[3,19]。ASOs作為一種能夠定位定量作用于中樞神經系統的新型治療方法，不僅能夠提升藥物的有效利用率，同時也減少了因進入外周屏障導致的不良反應。一般來說，ASOs具有良好的中樞神經系統透過作用，能夠更加特異性地作用于病變部位。同時ASOs還可以特異性作用于神經元核內的異常RNA聚積，減少神經元的衰亡[4～7,11,13,14,26]。

基礎研究突出了反義技術在神經系統退行性疾病治療中的巨大潛力，有望為神經系統退行性疾病的治療帶來希望。