泛素蛋白酶體途徑在癲癇發病機制中的作用研究進展

張賀博 劉曉亮 趙彥艷

中國醫科大學附屬盛京醫院臨床遺傳科，遼寧沈陽 110001

癲癇是最常見的神經系統疾病之一，全世界約有7000 萬人患有癲癇，其反復發作的特征對患者和家庭造成了沉重的負擔[1]。雖然人們在癲癇發病機制方面做了大量的研究工作，但由于病因復雜，迄今為止癲癇發病機制仍未完全闡明。泛素蛋白酶體途徑（ubiquitin proteasome pathway，UPP）作為生物體內內源性蛋白降解重要途徑之一，其功能失調與癲癇等神經系統疾病密切相關。本文就UPP 在癲癇發生發展中的作用展開綜述。

1 UPP 的組成

UPP 由泛素、泛素活化酶E1、泛素結合酶E2、泛素連接酶E3、26S 蛋白酶體以及去泛素化酶（DUBs）組成。泛素是含有76 個氨基酸殘基的小分子蛋白質，因其廣泛分布于各種真核細胞及組織中而得名。E1是一種廣泛表達的多肽，其結構和功能非常保守。E2結構域中央是決定E2 活性的半胱氨酸殘基，這些半胱氨酸殘基可以識別不同的E3 結構域。在人類基因組E3 大約有600 多種，其在特異性識別底物中最為重要。現已發現鑒定的E3 可分為4 種類型[2]：含有HECT 結構域的E3、 含有RING 結構域的E3、 含有U-box 結構域的E3 和含有PHD 類E3。26S 蛋白酶體是UPP 中降解蛋白質的核心構成，由1 個20S 核心蛋白酶和2 個19S 調節顆粒組成。19S 調節顆粒識別泛素化的靶蛋白使其去泛素化，并將去泛素的靶蛋白轉運到20S 核心蛋白酶腔內蛋白水解位點，最終在這些位點上目標蛋白被降解和回收[3]。DUB 是一種從底物蛋白中去除泛素或泛素樣分子并分解多泛素鏈的蛋白酶，在不同的細胞環境中調節UPP 介導的蛋白質降解[4]。

2 泛素化修飾過程

泛素化修飾是由E1、E2 和E3 三種酶協同作用介導泛素分子在底物蛋白上形成泛素鏈[5]。首先E1水解一分子的ATP 并將一個泛素分子腺苷酰化，E1 活性中心的半胱氨酸殘基與泛素的C 端甘氨酸殘基形成硫酯鍵，游離的泛素分子被活化；隨后活化的泛素被轉移到E2 的半胱氨酸殘基上，E2 將泛素轉移給泛素-蛋白連接酶E3；E3 直接或間接與底物蛋白結合，促使泛素C 端的羧基與底物蛋白的賴氨酸殘基ε 氨基基團上形成異肽鍵，或者連接有泛素的E2 與E3結合，E2 將泛素轉移到蛋白底物上，完成泛素化修飾[6]。泛素化修飾的蛋白可經由26S 蛋白酶體特異性降解，或者改變蛋白質的功能，進而影響細胞內許多重要的生理生化過程[7]。

3 UPP 與離子通道

許多影響中樞神經興奮性的離子通道蛋白都受UPP 的調節，如鈉離子通道（Navs）、鉀離子通道（Kvs）等電壓門控離子通道，以及AMPA 受體和N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體等配體門控離子通道。由于離子通道穩態在調節神經元興奮性中的重要作用，神經元中UPP 受損可能導致癲癇的發生[8]。

3.1 Nedd4-2 與Navs

在癲癇的遺傳學研究中證實，編碼電壓門控的Navs 蛋白的基因突變是特發性癲癇發生常見的原因。在神經系統中，Nav1 表達的亞型（Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8）通道蛋白的C 端都具有PY 模序，這給泛素E3 連接酶Nedd4-2 提供了一個相互作用的位點。SCN1A 基因編碼人類Nav1.1 通道，在大腦皮質及海馬表達最為豐富。Escayg 等[9]證實SCN1A 的突變可以破壞與Nedd4-2 的結合，從而阻止了Nedd4-2 對其進行泛素化，導致大腦神經元中Nav1.1 通道功能獲得，影響神經元的興奮性，最終參與癲癇的發生。Nav1.2（SCN2A）和Nav1.3（SCN3A）主要存在于神經元軸突處，Nav1.2 的功能障礙與良性家族性新生兒-嬰兒驚厥有密切聯系。Rougier 等[10]通過在HEK293 細胞以及非洲爪蟾卵細胞中過表達Nedd4-2，發現Nav1.2 和Nav1.3 的泛素化程度增強，并導致隨后質膜上離子通道水平的下調。但突變的SCN2A 與SCN3A 是否影響Nedd4-2 泛素化修飾，目前還不清楚。SCN8A 編碼Nav1.6 通道，對中樞和外周神經系統的神經元興奮性至關重要。O′Brien 研究團隊[11]通過構建條件性SCN8A 敲除小鼠模型，發現神經元持續電流和再發電流減少，降低了突變小鼠的神經元興奮性。Nedd4-2 包含WW1 和WW4 結構域，它們與Nav1.6 的C 端的Pro-Ser-Tyr1945 基序相互作用。Gasser 等[12]共表達Nav1.6 和Nedd4-2，研究發現Nedd4-2 可以顯著降低Nav1.6 峰值電流，并且該降低依賴于Nav1.6 的C 端Pro-Ser-Tyr 基序和L1 端的Pro-Gly-Ser-Pro 基序。另外有研究指出，DUB 家族成員中的泛素特異性蛋白酶（USP）增強了Nedd4-2 的磷酸化水平，并且進一步激活了Navs，使癲癇的發生更頻繁，神經元的丟失也更明顯[13]。

3.2 CRL4A 與Kvs

Kvs 是分布最廣、 類型最多的一類離子通道，在真核細胞中主要參與細胞膜靜息電位的形成以及動作電位的復極化的調節，因此在神經元和肌肉電興奮性方面發揮重要作用。Kvs 是由2 個α 亞基和2 個β亞基組成的四聚體，α 亞基組成通道孔，β 亞基維持鉀通道正常生理學特性。目前已發現與癲癇相關的Kvs 基因包括KCNA2、KCNC1、KCNT1 以及KCNQ 家族等，Kvs 基因的突變與癲癇的發生存在重要聯系。CRL4A 是一種E3，其屬于RING 家族一員。CRL4A通過適配器蛋白CRBN 構成E3 泛素連接酶復合體，與Kvs 相互作用，小分子藥物沙利度胺，可通過直接與CRBN 結合抑制CRL4A 連接酶底物特異性[14]。Liu等[15]研究表明，E3 連接酶抑制劑處理小鼠癲癇易感性增加，而Kvs 抑制劑處理可以減輕癲癇的發作；CRL4A 可以對Kvs 進行泛素化并將其定位于內質網，利用沙利度胺抑制CRL4A 活性，細胞膜Kvs 蛋白升高，神經元興奮性增強；DDB1 作為CRL4A 亞基，對其條件性基因敲除的小鼠進行癲癇誘導，與野生型小鼠相比癲癇敏感性增強。該研究提示CRL4A 介導的Kvs 泛素化修飾和CRL4A 活性在癲癇的發生中發揮重要作用。由于Kvs 的功能與癲癇之間存在廣泛的相關性，可預測CRL4A 可以成為提高癲癇發作閾值和降低癲癇發作敏感性的靶點[16-18]。Klassen 等[19]通過對特發性癲癇患者的樣本進行外顯子測序，發現Kvs存在突變，但是這些突變是否會影響CRL4A 介導的Kvs 泛素化，有待進一步的研究。

3.3 Nedd4 家族與谷氨酸門控離子通道

Nedd4 家族是含有HECT 結構域的E3。氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4- isoxazole-propionic acid receptor，AMPAR）是突觸后谷氨酸門控離子通道，介導哺乳動物大腦中快速興奮性神經遞質的傳遞。Nedd4-1 是第一個被證明與AMPAR 的亞基GluA1 在神經元中相互作用并促進泛素化的E3 連接酶。Schwarz 等[20]發現Nedd4-1 過表達使AMPAR 的表達降低。Scudder 等[21]發現過表達缺乏C2 結構域的Nedd4-1，不再引起AMPAR 表達降低。隨后Jewett 等[22]發現Nedd4-2 基因敲除可使AMPAR 的亞基GluA1 的泛素化水平下降，神經元活性升高，并證實GluA1 是Nedd4-2 的新底物。Zhu 等[23]通過構建腦組織條件敲除Nedd4-2 小鼠，發現小鼠皮層神經元過度活躍；通過GluA1 亞基泛素化增強海仁酸誘發癲癇的易感性；三種癲癇相關的Nedd4-2 錯義突變均破壞了GluA1 的泛素化；降低GluA1 的表達水平能夠糾正Nedd4-2 功能不足引起的癲癇易感性。Zhu 等[24]最新研究表明，缺乏C2 結構域的Nedd4-2 對GluA1 泛素化活性降低； 缺乏C2的Nedd4-2 抑制興奮性突觸強度。上述研究表明，Nedd4-1 與Nedd4-2 通過調節AMPAR 的亞基Glu-A1 泛素化，參與癲癇的發生。Kim 等[25]發現吡哆醛-5’-磷酸酶可以在Nedd4-2 的絲氨酸s448 位點去磷酸化，并加速Nedd4-2 的泛素化；在吡哆醛-5’-磷酸酶敲除鼠中，Nedd4-2 表達增加，并通過泛素化Glu-A1，減少GluA1 的細胞膜表面表達以抑制其功能；過表達吡哆醛-5’-磷酸酶后，增加了Nedd4-2 泛素化并促進癲癇發生進展。上述研究表明，吡哆醛-5’-磷酸酶介導的Nedd4-2 的去磷酸化通過GluA1 泛素化調節神經元興奮性。

NMDA 是存在于中樞神經系統的一類谷氨酸門控性離子通道受體，參與興奮性突觸傳遞、神經發育、突觸可塑性形成等多種中樞神經系統功能。中樞神經系統的興奮性突觸主要以谷氨酸為遞質，NMDA 受體表達上調是導致癲癇發作的一個重要因素[26]。當細胞內谷氨酸濃度升高，過度激活NMDA 受體，大量神經元突觸后膜發生同步性去極化，神經元產生持續的放電，最終導致癲癇的發作。Gautam 等[27]利用GST-Pull Down 和Co-IP 實驗證實，NMDA 受體亞基GluN2D和Nedd4 存在直接相互作用，Nedd4 的WW2 和WW3 結構域與GluN2DC 端PPXY 基序相互結合，增強GluN2D 的泛素化水平并降低了含有GluN2D 亞基的NMDA 受體的反應性。

4 小結

綜上所述，UPP 是生物體內蛋白質降解的重要途徑，其通過調節神經細胞表面電壓門控離子通道蛋白和配體門控離子通道蛋白泛素化水平，進而影響神經元的興奮性，最終參與癲癇的發生。癲癇發病機制復雜，當前研究主要是來自細胞和癲癇動物模型，可能需要大量的人類標本實驗來進一步證實。UPP 參與了癲癇發生發展過程，進一步揭示UPP 更多的靶蛋白，并從各個環節完善具體作用機制，將來為探索以UPP為切入點的癲癇治療藥物提供線索。