慢病毒介導miR-17過表達對潰瘍性結腸炎小鼠的影響及機制初探

潰瘍性結腸炎(UC)屬于炎癥性腸病(IBD)，好發于直腸和乙狀結腸[1]。UC的發病機制目前尚未完全明確，其與環境、遺傳、感染、細胞凋亡及免疫等多種因素相關。有研究顯示，腸道黏膜細胞對維持腸道微生態平衡具有重要作用，而腸道黏膜細胞凋亡率升高將導致腸道黏膜屏障受損[2]。腸道黏膜屏障受損與UC久治不愈、病情反復密切相關。miR-17是由6個序列相似、結構相仿的核苷酸組成的RNA分子，其序列高度保守，存在于基因組中內含子的非編碼區[3]。研究表明，miR-17主要與細胞凋亡、細胞周期調控相關[4]。本研究探討了miR-17過表達對UC小鼠結腸組織的影響及可能的機制，以期為UC的治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級BALB/c小鼠，雄性，共45只，體質量為25～32 g。由中國醫科大學提供，許可證號：SYXK(遼)2018-0087。室溫保持22 ℃～28 ℃，相對濕度35%～75%，晝夜自然光照，適應性飼養1周。

1.2 主要試劑與儀器

試劑：2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)(美國Sigma公司)，裂解液(美國BD公司)，Tunel檢測試劑盒(上海碧云天公司)，水合氯醛(天津福星公司)，BCA蛋白定量測定試劑盒(上海碧云天公司)，HE染色試劑盒(北京索萊寶公司)、RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒(美國Beyotime公司)，兔單克隆抗Bim抗體(美國PAA公司)，HRP標記羊抗兔二抗(上海碧云天公司)，SDS-PAGE凝膠配置試劑盒(南京建成公司)，ECL發光試劑盒(美國Thermo公司)。 儀器：垂直電泳槽、穩壓穩流電泳儀、RT-PCR反應擴增儀(美國Bio-Rad公司)。本研究由沈陽萬類生物公司設計引物，引物序列見表1。

1.3 分組與UC模型構建

35只小鼠適應性飼養1周后，禁食不禁水維持24 h，腹腔注射4%水合氯醛溶液(40 mg/kg)，待小鼠麻醉后，從小鼠的肛門插入直徑為5 mm的硅膠管，進深約8 mm；該管另一端連接注射器，一次性注射2.5%TNBS乙醇溶液(TNBS溶于50 %的乙醇水溶液)灌腸(100 mg/kg)，灌腸完畢后，提拉尾巴使小鼠倒立3 min，放回原籠繼續飼養，參照文獻[5]制作UC模型。隨機選取5只小鼠處死，取結腸組織進行病理學觀察，判斷小鼠UC模型構建成功與否。將30只UC模型構建成功的小鼠隨機分成模型組(B組)、模型+空載體組(C組)、模型+miR-17過表達組(D組)，每組10只；另取10只小鼠用上述方法注射100 mg/kg的生理鹽水灌腸，設為正常組(A組)。其中C組小鼠在第1、7、14、21天時于尾靜脈注射慢病毒空載體100 μL；D組小鼠于相同時間點注射等量的miR-17過表達慢病毒載體；最后1次注射1周后處死全部4組小鼠，并將結腸組織存于-80 ℃冰箱中。

表1 引物序列

1.4 小鼠癥狀觀察與評分

實驗開始后，每日記錄每只小鼠的體質量，觀察每只小鼠的糞便情況以及便血情況，根據UC的疾病活動指數(DAI)標準，并參照文獻[6]進行評分。具體如下：體質量無下降，糞便正常且無便血計0分；體質量下降<5 %，糞便松散且無便血計1分；體質量下降5 %～10 %，糞便松散有便血計2分；體質量下降11 %～15 %，稀便，有便血計3分；體質量下降>15 %，稀便，肉眼血便計4分。

1.5 HE染色觀察小鼠結腸組織病理變化

將固定于4 %多聚甲醛溶液中的結腸組織取出，然后進行脫水、透明、石蠟包埋和切片，對組織切片進行脫蠟、水化、染色和封片。利用顯微鏡觀察切片。

1.6 TUNEL法檢測小鼠結腸組織細胞凋亡情況

將小鼠結腸組織從4%多聚甲醛溶液中取出，制成石蠟切片；采用3 %過氧化氫溶液室溫孵育5 min，0.05 mol/L枸櫞酸鹽溶液100 ℃修復10 min，15%脫脂奶粉溶液封閉1 h，之后用1∶500 TUNEL檢測液室溫孵育90 min，1∶500熒光素抗體37 ℃孵育60 min，Hoechst室溫孵育5 min，封片，利用熒光顯微鏡觀察并拍照。結果判定標準：凋亡細胞的細胞核呈黃棕色或黃褐色，并且呈散狀分布，周圍無炎性細胞浸潤，核固縮或核碎裂。凋亡指數=(凋亡陽性細胞核數/總細胞數)×100 %。

1.7 RT-PCR法檢測小鼠結腸組織中Bim mRNA、PTEN mRNA的表達水平

從-80 ℃冰箱中取出小鼠結腸組織80 mg，加入RNAiso Plus 1 000 μL剪碎，研磨勻漿，室溫中加入各項反應試劑，37 ℃溫育，60 min；70 ℃溫育10 min。以U6為內參，95 ℃ 10 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，40個循環。采用2-ΔΔCt法對實驗數據進行分析。

1.8 Western Blot法檢測小鼠結腸組織中Bim蛋白的水平

從-80 ℃冰箱中取出小鼠結腸組織，加入裂解液[組織體質量(mg)∶裂解液(μL)=1∶9]，4 ℃離心20 min，提取上清液中的總蛋白，利用BCA蛋白檢測試劑盒檢測樣本總蛋白濃度；隨后加入25 %的上樣緩沖液，沸水浴10 min變性；應用SDS-PAGE凝膠配置試劑盒進行電泳；完畢后將蛋白轉移至PVDF膜上。1∶400兔單克隆Bim一抗4 ℃孵育過夜，1∶1 400 HRP標記羊抗兔IgG室溫孵育1 h，用ECL發光液避光顯影。應用Image J-pro 6.0 軟件進行灰度值掃描分析，得出目的蛋白表達的相對值。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 各組癥狀及DAI評分比較

A、B、C、D組小鼠DAI評分分別為(0.10±0.03)分、(3.60±0.05)分、(3.53±0.60)分和(1.57±0.36)分，差異有統計學意義(F=113.57，P<0.001)。與A組相比，B、C、D組小鼠的DAI評分均顯著升高，差異具有統計學意義(q=22.112 7、21.670 5、9.287 3，P<0.05)。與B組相比，C組小鼠的DAI評分差異無統計學意義(q=0.442 2，P>0.05)，而D組則顯著降低(q=12.825 4，P<0.05)。與C組相比，D組小鼠DAI評分顯著降低，差異有統計學意義(q=12.383 1，P<0.05)。

2.2 各組小鼠結腸組織切片病理學比較

A組結腸組織細胞排列整齊，無明顯的炎性細胞浸潤及纖維化，也沒有觀察到任何病變。與A組相比，B、C組小鼠結腸組織出現明顯的炎性細胞浸潤及纖維化，D組較B、C組明顯改善。見圖1。

2.3 各組小鼠結腸組織TUNEL分析比較

A、B、C、D 組小鼠結腸組織細胞凋亡指數分別為(4.05±3.97)%、(77.68±5.89)%、(71.98±6.72)%和(30.20±8.64)%，差異有統計學意義(F=288.81，P<0.001)。與A組相比，B、C、D 組小鼠結腸組織細胞凋亡指數均顯著升高，差異具有統計學意義(q=35.688 4、32.925 6，12.674 9，P<0.05)。與B組相比，C組差異無統計學意義(q=2.762 8，P>0.05)，而D組則顯著降低(q=23.013 5，P<0.05)。與C組相比，D組小鼠結腸組織細胞凋亡指數顯著降低，差異具有統計學意義(q=20.250 7，P<0.05)。見圖2。

圖1各組小鼠結腸組織光鏡下的病理改變 HE染色 ×200A正常小鼠B模型組C模型+空載體組D模型+miR-17過表達組

圖2各組小鼠結腸組織TUNEL分析 HE染色 ×200A正常小鼠B模型組C模型+空載體組D模型+miR-17過表達組

2.4 各組小鼠結腸組織中Bim mRNA、PTEN mRNA的表達水平比較

如表2所示，4組小鼠結腸組織中Bim mRNA、PTEN mRNA的表達水平相比較，差異有統計學意義(F=36.88、86.67，P<0.001)。與A組相比，B、C、D組小鼠結腸組織中Bim mRNA、PTEN mRNA的表達水平均顯著升高，差異具有統計學意義(q=12.694 4、12.933 9、7.305 3，P<0.05；q=17.985 9、19.569 6、6.900 3，P<0.05)。與B組相比，C組小鼠結腸組織中Bim mRNA、PTEN mRNA的表達水平差異均無統計學意義(q=0.239 5、1.587 3，P>0.05)，而D組則均顯著降低，差異具有統計學意義(q=5.389 1、11.085 7，P<0.05)。與C組相比，D組小鼠結腸組織中Bim mRNA、PTEN mRNA的表達水平均顯著降低，差異具有統計學意義(q=5.628 6、12.669 3，P<0.05)。

表2 各組小鼠結腸組織中Bim mRNA、PTEN mRNA的表達水平

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05；與C組比較，cP<0.05

2.5 各組小鼠結腸組織中Bim蛋白的表達水平比較

A、B、C、D組小鼠結腸組織中Bim蛋白的相對表達水平分別為0.39±0.16、0.93±0.17、0.70±0.18和0.36±0.18，差異具有統計學意義(F=17.25，P<0.001)。與A組相比，B、C組小鼠結腸組織中Bim蛋白的相對表達水平均顯著升高，差異具有統計學意義(q=7.869 7、5.605 9，P<0.05)。與B組相比，C組小鼠結腸組織中Bim蛋白的相對表達水平差異無統計學意義(q=2.260 0，P>0.05)，而D組則顯著降低(q=8.398 3，P<0.05)。與C組相比，D組小鼠結腸組織中Bim蛋白的相對表達水平顯著降低，差異具有統計學意義(q=6.138 3，P<0.05)。見圖3。

圖3 各組小鼠結腸組織中Bim蛋白的表達

3 討論

UC患者多伴有腸道炎性反應和腸道黏膜潰瘍性損傷，主要表現為腹痛、腹瀉等[7]。研究發現，UC是誘發結直腸癌的危險因素[8]。UC的病因較為復雜，其發病機制尚未完全闡明，多數學者認為其發病機制可能與遺傳、環境、免疫、腸道菌群失調及黏膜細胞過度凋亡等因素有關[9-12]。UC反復發作可能是因結腸黏膜細胞凋亡增多導致屏障功能受損所致[13]。因此，抑制腸道黏膜細胞凋亡可能對UC的腸道屏障修復起重要作用。本研究給予小鼠2.5% TNBS乙醇溶液灌腸構建UC模型，通過慢病毒轉染miR-17使之過表達抑制腸道黏膜細胞凋亡，觀察UC小鼠的癥狀及結腸黏膜病理變化，并探究其機制。

本研究基于小鼠的癥狀、體征、DAI評分和小鼠結腸組織病理學檢查，評價UC造模成功與否，結果顯示，與正常小鼠相比，UC模型小鼠出現明顯的UC癥狀及體征，并且DAI評分明顯升高，小鼠結腸組織出現明顯病理損傷，表明UC小鼠模型造模成功。本研究觀察了慢病毒介導miR-17過表達對UC小鼠的影響，并通過光鏡觀察各組小鼠結腸的病理變化，結果表明過表達miR-17可能減輕UC小鼠結腸組織的病理損傷，使得潰瘍得到抑制并逐漸愈合。本研究結果表明，UC小鼠結腸黏膜細胞的凋亡指數顯著增加，導致潰瘍加重，而過表達miR-17可使小鼠結腸黏膜細胞的凋亡指數明顯下降；同時，本研究進一步驗證了Bim mRNA、PTEN mRNA及Bim蛋白的表達情況，也得出上述結論。提示過表達miR-17可能是通過降低Bim蛋白表達而抑制了PTEN/Akt通路，下調UC小鼠結腸黏膜細胞的凋亡，從而使得UC小鼠的結腸組織潰瘍受到抑制。

綜上所述，過表達miR-17對UC小鼠具有保護作用，其機制可能與降低Bim蛋白表達及抑制PTEN/Akt通路有關，推測miR-17可能是UC的新靶點，但其具體機制還需要進一步探究。