復方芎參軟膠囊的提取工藝

鄭望升 蔣宇佳 呂慧群 商鐵存

復方芎參軟膠囊是由川芎、丹參等中藥組成的復方制劑，具有行氣、活血、化瘀、通脈功效，主要用于腦動脈硬化、缺血性腦中風及腦出血后遺癥等治療。該制劑遵循氣行血行的中醫理論，具有服用方便、生物利用度高、密封性好等特點。方中丹參的主要成分丹參酮ⅡA 具有誘導血管內膜平滑肌細胞分化成熟和凋亡，抗急性缺氧、保護神經細胞等藥理學作用[1-2]。川芎主要含有揮發油、生物堿、酚酸等成分，其酚酸類成分阿魏酸是其主要藥效成分，具有抑制血小板聚集，抑制血小板釋放5-羥色胺（5-HT），阻止顱內外血管異常舒縮，改善血液循環等功效[3-4]。本實驗設計了川芎超臨界萃取工藝和丹參醇提工藝相結合的提取工藝，采用正交試驗法，分別以阿魏酸和丹參酮ⅡA 為考察指標，優化 復方芎參軟膠囊的提取工藝，為制劑生產提供實驗依據。

1 材料與儀器

1.1 材料

川芎（浙江康寧醫藥有限公司，批號151211）；丹參（浙江康寧醫藥有限公司，批號150814）；阿魏酸對照品（中國藥品生物制品檢定院，批號110773- 201313）；丹參酮ⅡA 對照品（中國藥品生物制品檢定院，批號110766-200619）；甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

HA123-50-02G 型超臨界萃取裝置（南通儀創實驗儀器有限公司）；MS105DU 分析天平（METTLER TOLEDO）；Agilent1200 高效液相色譜儀。

2 方法與結果

2.1 川芎的CO2 萃取

2.1.1 因素水平設計根據文獻[3,5-7]及預實驗，以阿魏酸提取率作為評價指標，采用正交試驗優化萃取工藝，選取萃取溫度（A）、萃取壓力（B）、萃取時間（C）作為考察因素，各取3 水平，進行L9（34）正交試驗，篩選最佳工藝條件。見表1。

表1 萃取川芎因素水平

2.1.2 試驗方法根據以上因素水平，進行L9（34）正交試驗，準確稱取川芎藥材9 份，每份400 g，按照正交試驗表所示條件萃取，收集萃取液，作為樣 品備用。

2.1.3 阿魏酸含量的測定

阿魏酸含量的測定參考文獻[8-9]。

色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇：1%醋酸溶液（30：70）為流動相；檢測波長為320 nm；進樣量為10 μl。阿魏酸對照品與川芎提取物樣品的高效液相色譜法（HPLC）色譜圖如圖1所示。

對照品溶液制備：取阿魏酸對照品適量，精密稱定，置于棕色容量瓶中，加70%甲醇制成1 ml 含98 μg 溶液，即得。

供試品溶液制備：取本品0.1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 ml，密塞，搖勻，靜置，濾過，取續濾液，即得。

線性關系考察：分別準確量取對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml 于100 ml 容量瓶中，然后用70%甲醇定容至刻度，混勻，分別精密吸取上述溶液各10 μl，進樣檢測，以峰面積為縱坐標（Y），以質 量濃度（μg/ml）為橫坐標（X）繪制標準曲線，得線性回歸方程為Y=11 819X+601.4，相關系數r=0.999 5。線性范圍在0.98～4.90 μg/ml，線性關系良好。

精密度試驗：準確吸取對照品溶液10 μl，按上述色譜條件測定重復測定5 次，以峰面積計算，相對標準偏差（RSD）值為0.99%（n=5），結果表明精密度良好。

穩定性試驗：準確吸取同一供試品溶液，分別放置0、4、8、12 h 后，按上述色譜條件測定峰面積，計算出RSD 值為1.7%（n=4）。表明供試品溶液在12 h 內穩定性相對良好。

重復性試驗：準確稱取川芎提取物樣品5 份，按上述供試品溶液制備方法平行制備5 份供試品溶液，按上述色譜條件測定峰面積并計算阿魏酸含量，RSD 值為2.00%（n=5），表明該方法重復性良好。

加樣回收率試驗：準確量取已知含量的同一批川芎提取物供試品溶液9 份，分別加入樣品量80%、100%、120%的對照品，按上述供試品溶液制備方法制備，在上述色譜條件下檢測阿魏酸的平均回收率為100.48%，RSD 值為1.86%，結果表明該方法具有較好的回收率。見表2。

2.1.4 正交試驗結果及方差分析按L9（34）正交試驗條件進行萃取，共得到9 份萃取液，測定阿魏酸提取率。結果見表3，方差分析見表4。由表3可知，影響萃取效果的因素順序為萃取溫度（A）＞萃取壓力（B）＞萃取時間（C），直觀分析可知A3B3C3為提取阿魏酸最佳方案。由表4可見，因素A 對試驗結果影響顯著。從經濟易控考慮，選擇方案A3B2C1為最佳方案，即萃取溫度70 ℃、萃取壓力29 MPa、萃取時間1.5 h。

表2 加樣回收率試驗(n=9)

表3 L9(34)正交試驗結果

表4 萃取工藝方差分析

2.2 丹參提取工藝優選

2.2.1 因素水平設計根據文獻[10-13]及預實驗，以丹參酮ⅡA 為評價指標，采用乙醇提取工藝，選取溶媒濃度（A）、提取時間（B）、提取次數（C）、溶劑用量作為考查因素，各取3 水平，采用L9（34）正交試驗，篩選最佳萃取工藝條件，因素水平見表5。

2.2.2 試驗方法根據以上因素水平，按照L9（34）正交試驗表，準確稱取處方量丹參等藥材9 份，每份200 克，按照L9（34）正交試驗表所示條件提取，收集提取液，干燥作為樣品備用。

表5 丹參提取工藝因素水平

2.2.3 丹參酮ⅡA 含量測定

丹參酮ⅡA 含量測定參考文獻[14]。

色譜條件：色譜柱為DiamonsilTM—C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以甲醇：水（85：15）為流動相；檢測波長為270 nm；進樣量為10 μl。丹參酮ⅡA 對照品與丹參提取物樣品的HPLC 色譜圖如圖2所示。

對照品溶液制備：取丹參酮ⅡA 對照品適量，精密稱定，加甲醇制成1 ml 含0.5 mg 的溶液，即得。

圖2 丹參酮ⅡA 對照品和丹參提取物HPLC 色譜圖

供試品溶液制備：取本品約0.02 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率140 W，頻率42 kHz）30 min，冷卻，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

線性關系考察：分別準確吸取對照品溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 ml 于50 ml 容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，搖勻，分別精密吸取上述溶液各10 μl，進樣檢測，以峰面積為縱坐標（Y），以質量濃度（μg/ml）為橫坐標（X）繪制標準曲線，得線性回歸方程為Y=12 233X+3 411，相關系數r=0.999 5，線性范圍在4.3～21.8 μg/ml，線性關系良好。

精密度試驗：準確吸取對照品溶液10 μl，按上述色譜條件重復測定5 次，以峰面積計算，RSD 值為0.50%（n=5），表明精密度良好。

穩定性試驗：準確吸取同一供試品溶液，分別放置0、4、8、12 h 后，按上述色譜條件測定峰面積，計算出RSD 值為0.55%（n=4）。表明供試品溶液在12 h 內穩定性相對良好。

重復性試驗：準確稱取同批次丹參提取物樣品5 份，按上述供試品溶液制備方法平行制備5 份供試品溶液，按上述色譜條件測定峰面積測定并計算丹參酮ⅡA 含量，RSD 值為1.47%（n=5），表明該方法重復性良好。

加樣回收率試驗：準確量取已知含量的同一批丹參提取物供試品溶液9 份，分別加入樣品量80%、100%、120%的對照品，按供試品溶液制備方法制備，按上述色譜條件下檢測丹參酮ⅡA 的平均回收率為99.40%，RSD 值為1.02%，結果表明該方法具有良好的回收率。見表6。

2.2.4 正交試驗結果及方差分析按L9（34）正交 試驗條件進行提取，共得到9 份提取液，干燥后，測定丹參酮ⅡA 提取率。結果見表7，方差分析見表8。由表7可知，影響提取效果的因素順序為提取次數（C）＞溶媒濃度（A）＞提取時間（B）＞溶劑用量（D），直觀分析可知A3B2C3D2為提取丹參酮ⅡA的最佳方案；由表8可知，因素A、B、C 對試驗結果影響顯著，溶劑用量（D）影響不大。從節約濃縮時間、能耗等方面考慮，選擇方案A3B2C3D1為最佳方案，即溶媒濃度90%、提取時間1.5 h、提取次數3 次、6 倍量提取溶媒。

2.3 最佳提取工藝驗證

根據正交試驗優選出的最佳提取工藝，分別對川芎萃取和丹參提取進行了3 批樣品的驗證研究，RSD 分別為2.61%、2.19%，結果表明該工藝穩定、合理可行，可以作為復方芎參軟膠囊的提取工藝。見表9。

3 討論

中藥成分復雜，如何將有效成分提取完全，是實驗過程中考慮的關鍵因素。川芎為我國傳統中藥材，具有活血行氣、祛風止痛功效[15]。現代藥理學研究表明，揮發油和阿魏酸是川芎的重要藥效成分[16]。常規提取揮發油以水蒸氣蒸餾法為主，存在溫度高、時間長、提取率低等問題，容易導致熱敏性內酯成分破壞。阿魏酸多采用回流、超聲等方法重新提取。本制劑采用超臨界CO2萃取的方法提取川芎揮發油和阿魏酸，實現了兩者的有效結合，同時具有時間短、效率高等特點[3-6]。

本研究通過正交試驗對川芎的超臨界萃取工藝和丹參藥材醇提工藝進行了優化篩選，并進行了重復性驗證試驗，最終確定了本制劑的藥材提取工藝，即川芎萃取優化工藝為萃取溫度70 ℃、萃取壓力29 MPa、萃取時間1.5 h；丹參藥材提取優化工藝為90%乙醇、提取時間1.5 h、提取次數3 次、6 倍量提取溶媒。該工藝合理、可行，為復方芎參軟膠囊的開發提供了依據。

表6 加樣回收率試驗(n=9)

表7 L9(34)正交試驗結果

表8 提取工藝方差分析

表9 工藝驗證結果