基于微流控技術的細菌檢測技術研究①

賈亦琛 徐勝男 林淑英 王晨 張月穎 蘭添 宋婷婷 陳培培 宋波

(齊齊哈爾醫學院醫學技術學院 黑龍江齊齊哈爾 161000)

1 微流控芯片簡介

微流控芯片（microfluidic chip）又稱微全分析系統(Miniatrized Total AnalysisSystem ，μ-TAS)，是一種若干平方厘米以硅、石英、玻璃或高分子聚合物等材料制作的芯片，具有微米尺度空間并對流體進行操控的技術產品，具有小型化、高通量、試劑消耗微量、分辨率高、自動化、靈敏度高、操作簡單等突出優點[1]。微流控芯片利用微米尺度空間對流體進行操控的特征將實驗室中：采樣、稀釋、加樣、反應、分離、檢測等基本操作集成在一塊芯片上，實現常規實驗室多功能技術平臺。

微控流芯片的加工技術主要依托于微電子加工技術，采用標準軟刻蝕工藝加工，即在玻璃基板上旋涂光膠，繼而遮蔽含有微通道圖形的掩膜，曝光及顯影后得到模具。現有的微流控芯片的基本加工技術主要包括注塑法[2]、光刻和蝕刻技術等。注塑法使Soildworks軟件設計微流控芯片所需模具結構，使用3D打印機打印芯片模具，其主要優點是模具可多次重復使用萬次，芯片加工時間短、成本低、適合芯片的批量產，但其只能使用熱塑性材料，模具價格高、制作復雜[3]。

2 傳統的微生物檢測技術

傳統微生物檢測有三種方法：(1)直接顯微鏡觀察，正常情況，在一定的培養條件下（相同的培養基、溫度以及培養時間），同種微生物表現出穩定的菌落特征。可以通過顯微鏡觀察菌落特征對微生物種類進行判斷。(2)選擇培養基培養微生物或人為提供有利于目的菌株生長的條件，選擇培養基，其作用是允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他微生物生長。選擇培養一般是通過觀察微生物的同化作用類型或某一特征進行間接判斷，得到的微生物往往并不只有一種，但是能夠大致確定這些微生物存在的共有特征從而對其分類。(3)鑒別培養基，根據微生物的代謝特點，在培養基中加入某種指示劑或化學藥品。與選擇培養相比，鑒別培養基的鑒別所得結果的范圍比較小，一般可直接測定某微生物的種類。除此之外還包括血清學鑒定和分子生物學鑒定，但微生物的檢測金標準仍然是培養法[4]，但該方法耗時長、操作繁瑣、靈敏度低，通常要耗時18～24h。

噬菌體裂解試驗鑒定菌型，免疫熒光，放射核素和酶聯免疫（ELISA）三大標記技術及聚合酶鏈反應（PCR）等各種微生物學檢驗新技術也應用于臨床。但這些技術操作繁瑣、試劑樣品耗量大，樣品配置、濃縮等步驟耗時長，檢測前，需要復雜的樣品處理程序，且無法判斷微生物是否存活，容易出現假陽性[5]。

3 微流控芯片檢測技術在微生物檢測中的應用

新型微流控技術現已在核酸分離和定量分析、DNA測序及各類病原體的檢測等方面廣泛應用，在蛋白、氨基酸、PCR產物等領域也有了成熟的檢測技術，其基于免疫分析原理，主要以抗原、抗體和熒光靶標為新型標記物[6]。

現有的新型微流控技術主要包括如下幾種：(1)電化學芯片具有靈敏、快速等檢測優點，細菌懸液通過檢測孔時，表面性質產生不同脈沖信號，并將其轉化為細菌數量和種類等相關信息。但電阻抗芯片對設備要求及設計成本，在以后的研究中應努力降低材料成本[7]。(2)基因芯片功能的實現主要基于雜交測序方法，將某種已知核酸探針固定于基質，待測菌的核酸序由于與探針形成特異性反應，從而可以被捕獲，依據最大熒光強度的探針分布，從而確定被檢測核酸的探針序。(3)環介導等溫擴增技術（loop-mediated amplification,LAMP）在細菌、耐藥基因、病毒、寄生蟲和真菌的鑒定方面近些年受到學者們的廣泛關注，其中在細菌檢測應用最為廣泛。(4)紙質微流控芯片是經過多種加工修飾，使得紙上形成疏水網絡[8]，價格低廉且易于攜帶，但由于其機械韌性較差，方法復雜，制作時間長，因此不利于大規模生產。(5)非接觸電導檢測分析法是一種能檢測色譜柱流出的組分和其量的變化的儀器，其中的電導檢測器是離子色譜中最為常見的檢測器[9]。(6)介電泳分離技術是基于低壓電頻信號對中性粒子進行特異性的操控的原理，其反應速度快，可針對多種粒子，因而有更廣泛的應用。在微流控系統中介電泳技術是實現粒子分離和富集的關鍵技術之一。(7)化學發光免疫分析法：化學發光免疫分析法是化學發光和免疫分析相結合而形成的一種新型的檢測方法，以化學發光試劑標記抗原或抗體，與待測物經過一系列的免疫反應和理化反應后，根據發光強度判斷待測物的含量[10]。在微流控芯片上進行化學發光檢測具有顯著的優點，非常適合在微通道中進行。

4 微流控芯片的發展趨勢及展望

隨著各種信息技術的快速發展微流控芯片技術得到了進一步的提升，主要表現在:(1)提高微流控芯片的精準分析能力，并融合多種新技術;(2)將互聯網系統與微流控芯片技術相結合。目前,芯片實驗技術仍舊處于早期的研究階段，但芯片技術憑借著其顯著的優勢以及巨大的商業價值，目前為止也仍然在迅速發展，特別是集PCR技術、毛細管電泳、熒光標記于一身的微流控芯片，其在基因測序、基因表達、疾病診斷等各個領域的應用前景已經獲得人們的極大關注[11]。

過去十年中提出了很多快速檢測細菌的方法，如基于核酸(PCR，NASBA和RPA)，基于免疫學(ELISA，LFD和LAT)，以及基于生物傳感器(光學，電化學和基于質量的生物傳感器)方法，但這些方法都存在許多不足[12]，無法滿足臨床對于病原微生物快速診斷及治療的需求。從目前發展現狀來看，微流控芯片已經突破了傳統及原有技術所帶來的難題，并且在眾多領域中有了更深層次的研究，并不斷擴大應用范圍于更多領域。相信在未來的幾年內，以微流控技術為核心的技術將會取代更多的檢測系統，給人們帶來更便捷、安全、高效、靈敏的檢測產品。