異基因造血干細胞移植對腸道菌群的影響

張 麒，王月嬋，項 燕，徐建清，李佳琪，魏天蕊，劉 偉

異基因造血干細胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)是一種治療各種血液惡性腫瘤、骨髓衰竭性疾病以及遺傳代謝或缺陷異常的免疫治療方法[1]。治療策略是術前采用超大劑量化療和全身放療，清除腫瘤細胞或免疫細胞，然后將正常供者的造血干細胞植入到患者體內，使患者得以重建正常的造血和免疫功能，從而治愈疾病，移植期間需要使用大量抗生素來預防和治療感染。由于allo-HSCT會出現許多嚴重的并發癥，如移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)(22%)、感染(11%)、繼發性惡性腫瘤(7%)、肺部并發癥(5%)、心臟毒性(2%)和其他治療相關的事件(8%)[2],限制其臨床應用。其中，腸道GVHD最為嚴重，也是最難治療的，亦是allo-HSCT術后死亡的主要原因之一[3]。近30年來的研究表明，腸內菌群結構與allo-HSCT后患者的感染風險、GVHD以及死亡率密切相關[4]。腸道菌群不僅在患者免疫系統中起著關鍵作用，而且還可以保護患者免受病原體的影響[5]。因此，通過調節腸道菌群有望成為改善allo-HSCT預后的主要突破口。作者對allo-HSCT后患者的腸道菌群與GVHD之間的關系作一綜述，進一步總結通過平衡腸道菌群的多種治療方法，為臨床上改善移植預后，降低死亡率提供治療策略。

1 腸道菌群與allo-HSCT后GVHD的研究

1.1 腸道菌群失衡導致GVHD產生 導致allo-HSCT后出現GVHD的主要原因，除了供體和受體之間的組織相容性抗原的差異外，腸道菌群的失衡也是原因之一。在正常機體內，腸道免疫上皮細胞位于胃腸道內腔邊緣，作為屏障橋接傳送從腸道微生物群發送到免疫細胞和其他細胞的關鍵信息[6]。腸道免疫上皮細胞具有模式識別受體，如Toll樣受體和NOD樣受體，這些受體是識別與微生物相關的病原體相關模式分子(包括脂多糖、肽聚糖等)的必需元素[7]。最重要的是，模式識別受體還可以感知被破壞的宿主組織的危險相關分子模式信號，是重要防御屏障。另一方面，腸道免疫系統還發揮持續監測微生物群結構和豐度的作用[6]。

Allo-HSCT術前采用超大劑量化療和全身放療以及治療過程中使用大量抗生素，導致腸道菌群失衡，出現一些微生物菌群的過度生長，例如屬于變形菌門的細菌，可能會產生過量病原體相關模式分子，導致炎癥加劇和免疫耐受性喪失。腸道完整性的破壞，導致腸道滲漏現象[8]，使得細菌脂多糖等物質從受損的腸道中釋放出來，進入血液循環并到達全身組織器官，與免疫細胞表面的受體(即Toll樣受體4和CD14)的相互作用激活機體相關淋巴組織、單核吞噬細胞系統等，分泌大量炎性因子，引發全身性低度炎癥[9]，導致代謝性內毒素血癥，包括胰島素抵抗，葡萄糖耐受不良，血脂異常和肝臟脂肪變性[6]，引起皮疹、胃腸功能紊亂及出血和黃疸等疾病。

1.2 GVHD加重腸道菌群失衡 GVHD對腸道菌群的影響受到越來越多的關注。最近的報道表明，在allo-HSCT后出現的GVHD可進一步加重具有重要體內平衡作用的細菌數量失調，特別是在中性粒細胞減少期[10]。與移植前相比，腸道生態系統的物種豐富度下降了約30%，主要是厚壁菌門和擬桿菌比例減少、腸球菌和乳桿菌比例增加以及細菌多樣性改變，這些變化與死亡率呈正相關[4]。例如，研究發現GVHD可能通過減少梭狀芽胞桿菌的豐度來消耗消炎細胞群，從而加重GVHD的嚴重程度[11]。動物實驗證明：從人類糞便中重新引入17種梭狀芽胞桿菌分離物，可以延長GVHD小鼠的存活時間。

2 腸道微生物的檢測及未來的研究方向

2.1 微生物治療新型疾病 由于過去15年中先進基因測序工具和生物信息學平臺的快速發展，科學家們能夠較好描述腸道微生物群和微生物組的組成和功能。收集到的這些大數據強烈表明腸道細菌在維持腸內穩態和調節宿主代謝方面發揮重要作用。在對微生物群研究過程中，一些腸道細菌成為了新型疾病治療的潛在來源，例如頑固性便秘[12]。只是大多數研究還都集中在細菌對這些疾病的作用上，關于真菌和病毒對這些疾病以及微生物組的微妙平衡知之甚少，預計這將是未來一個廣闊且富有成效的研究領域[13]。

2.2 腸道菌群多樣性檢測新途徑 最近，許多關于微生物組研究的學科重新崛起，比如用于表征微生物組的高通量方法的進步，促進了與HSCT有關的微生物組研究的快速增長，推動了醫學的向前發展。常用的方法包括用于細菌分類學分類的16SrRNA基因測序，代謝組學，以及基因組測序和隨后的微生物基因的分類學和功能分類等[14]。其中利用細菌的16SrRNA具有保守序列和特異序列的特點進行測序，可以檢測已知甚至未知的微生物種類，也可以檢測到低豐度的細菌，進而可以全面、系統地通過α-多樣性和β-多樣性進行組內和組間的多樣性分析，因此可以更好的發現菌群結構差異。相對其他幾種方法，其結果準確度更高，是目前腸道微生物領域應用最為廣泛的方法[5]。

大規模測序技術的最新進展使得能夠徹底評估接受allo-HSCT患者的微生物群的變化，并且在allo-HSCT背景下微生物群的有益和有害變化的證據也開始積累[4]。對于一些復雜的可引起腸道菌群較大改變的代謝疾病,高通量測序技術可以準確地分析菌群多樣性的改變。例如在關于糖尿病的研究中,Wirth等[15]采用高通量技術檢測發現1型糖尿病大鼠和胰島素治療大鼠在不同的腸道區域有特異性腸道微生物群的組成。這些新途徑提高了我們對復雜的人類相關微生物群落的理解，包括微生物群落結構，功能潛力和實現的基因表達活動等方面[16]。

2.3 宏蛋白組學為微生物治療預后提供幫助 在移植期間，腸道菌群組成有著顯著變化，物種豐度的變化和多樣性的測量已被提出作為臨床移植后患者預后相關的潛在生物標志物。宏蛋白質組學即是在特定時間，通過質譜法來檢測環境微生物群完整的蛋白質組成，其可以將腸道菌群蛋白的差異表達與腸道菌群功能聯系起來，以達到預測菌群功能差異的作用。宏蛋白質組學可以直接說明腸道菌群的功能，其檢測出的一些特異的蛋白質可以作為疾病診斷、預后和治療的生物標志物[5]。如果可以確定微生物群和移植結果之間的因果關系，這些關系可以為基于微生物群的治療的預后發展提供有效信息，以改善移植結果。

3 Allo-HSCT后GVHD的常用治療方法

3.1 益生菌療法 多項研究表明，微生物群多樣性的改變增加了受體對腸道介導疾病(如腹瀉、感染和急性GVHD)的敏感性[17]。益生菌可以改變腸道菌群多樣性，改善腸道的屏障功能[18]，調節腸道免疫應答，降低腸道細菌感染率，還可以通過調節各種信號通路，誘導粘液和抗菌肽的產生。益生菌治療主要包括直接引入一種菌種或選定特定微生物群，常用益生菌包括雙歧桿菌、芽孢桿菌和乳酸菌。其中，口服鼠李糖乳桿菌GG株效果較為顯著，在同種異體移植小鼠模型中，接受鼠李糖乳桿菌GG株治療的小鼠組術后GVHD明顯減輕，存活率較高。而未接受鼠李糖乳桿菌GG株組小鼠術后GVHD發生率高，常伴隨多種腸道細菌感染(如艱難梭菌)[19]。另一個重要研究發現，梭狀芽孢桿菌通過上調腸道中的調節性T細胞來預防炎癥，表明GVHD可能通過減少梭狀芽孢桿菌的豐度來消耗消炎細胞群[11]，這對用益生菌治療allo-HSCT后GVHD具有重要意義。

然而，益生菌治療也有其局限性。首先，將益生菌運到下消化道，會因為胃的強酸環境而使其明顯喪失活力和代謝特征。其次，在患者免疫功能過度低下時，引入益生菌可能會增加患菌血癥或敗血癥的風險。

3.2 糞便菌群移植療法 目前,糞便菌群移植(fecal microbiota transplantation,FMT)可能成為治療allo-HSCT后腸道菌群感染的有效方法。FMT是指將健康個體的糞便懸浮液通過鼻胃管插管或內鏡下注入患者消化道中，來恢復患者微生物群落多樣性[20]，目前已成功應用于非HSCT患者復發艱難梭菌感染的治療。但FMT也存在較大風險，因為排泄物中含有大量有害細菌、病毒和寄生蟲，可能會危害到機體健康[21]。現有1種新的FMT，是通過第三方冷凍、封裝的接種，以口服膠囊的途徑進行[11]，這種途徑的好處在于膠囊制備前，對供體血液和糞便進行了大量篩選實驗，從而保證所有感染篩選實驗均在正常范圍或陰性范圍內，降低了患者接受FMT后細菌感染率。同時口服冷凍FMT膠囊還可以避免心理創傷，緩解心理壓力，減少痛苦。在1項開放標簽單組試驗研究中，數名接受allo-HSCT后受試者再接受FMT治療，12個月的總體生存率和無進展生存率分別為85%(95%CI:51%～96%)和85%(95%CI:51%～96%)，其中1例死于急性胃腸道GVHD;另外1項針對血液疾病患者進行HSCT時使用FMT的前瞻性研究表明，FMT可以清除受體的胃腸道中耐抗生素細菌[22]，相比萬古霉素的治療，FMT治療明顯改善了與反復艱難梭菌感染相關的腹瀉(OR=3.24，95%CI:1.85～5.68)[3]。由于缺乏臨床試驗數據，而且FMT長期安全性尚不清楚，因此，患者在接受FMT后，長期隨訪有一定必要性[23]。

3.3 選擇性消化道去污療法 選擇性消化道去污(selective digestive decontamination,SDD)即通過口服腸道不吸收的抗菌藥和抗生素，選擇性清除腸道中可能致病的需氧革蘭陰性細菌及其他細菌，以達到預防感染的目的。由于allo-HSCT患者在術后會因自身口咽與胃腸道潛在致病微生物(potentially pathogenic microorganisms,PPMs)移生而易發生感染，因此SDD可能成為治療allo-HSCT后PMMs感染的有效方法之一。在1項研究中，63名患者被選擇性地用不可吸收的抗生素去污，大多數患者的口腔在3 d內就無PPMs存在，5 d后直腸感染率明顯下降，其中9例患者發生了PPMs二次感染[24]。新的研究發現，112名兒童因血液系統惡性腫瘤接受allo-HSCT，為清除胃腸道內兼性嚴格厭氧微生物，使用大劑量非吸收性抗菌藥物進行全胃腸道去污，大約一半的兒童被證明成功去污，術后GVHD發生率顯著降低，預防方案包括使用利福昔明以及全身性頭孢噻肟鈉[25]。在HSCT患者中使用利福昔明可以保持腸道菌群多樣性，并與使用環丙沙星和甲硝唑聯合治療的患者相比降低了治療相關死亡率。但是SDD的臨床應用也存在潛在危險，特別是耐藥細菌的誘導產生。抗生素使用不當將導致細菌耐藥，一旦耐藥產生，逆轉是艱難而緩慢的，可以說目前阻礙SDD的最大障礙就是對SDD是否會導致細菌耐藥。

3.4 吲哚和吲哚衍生物治療 由共生細菌利用色氨酸酶產生的吲哚和吲哚衍生物可以通過誘導抗透明質酸酶反應依賴性的IL-22的轉錄和黏膜免疫穩態，從而增強上皮屏障的完整性、減輕炎癥。最新的研究發現，無論是由大腸桿菌菌株產生的吲哚還是由外源性給藥產生的吲哚和吲哚衍生物都被證明能顯著降低GVHD的嚴重程度、腸上皮的損傷以及跨上皮細菌的易位[23]。因此，利用吲哚及其衍生物是未來治療GVHD的另一個方向。

4 總結與展望

由于研究和應用條件的差異，實驗動物和人的種屬差別、臨床樣本量偏小、取樣樣本單一(大多數評估allo-HSCT后腸道微生物特征的研究僅依靠直腸取樣)以及腸道微生物群可能受到許多其他因素的影響，使得我們需要更多的研究來揭示這些機制，更好地描述腸道細菌介質對GVHD的作用，最終建立新策略來調節腸道菌群，減輕GVHD，同時維持宿主免疫功能，改善allo-HSCT的預后。