人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在帕金森病治療中的研究進(jìn)展

甄雋穎， 鄭曉丹綜述， 吳 軍審校

帕金森病(PD)是繼阿爾茨海默癥(AD)后第二大常見的神經(jīng)退行性疾病，多由腦內(nèi)產(chǎn)生多巴胺的細(xì)胞受損或凋亡引起，好發(fā)于 60 歲以上的老年人，成為繼腫瘤和心血管疾病之后威脅老年人身心健康的第三大殺手。據(jù)統(tǒng)計，目前全球約 1000 萬老年人遭受 PD 的影響，每年對于該病的護(hù)理和治療費用高達(dá) 570 億美元，而這一數(shù)值還在持續(xù)上升。PD臨床上以靜止性震顫、運(yùn)動遲緩、肌強(qiáng)直和姿勢平衡障礙為主要特征[1]，目前仍沒有根治的治療手段。近年來，干細(xì)胞如人類胚胎干細(xì)胞(hESCs)、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、多能干細(xì)胞(iPSCs)等等[2]，為PD的研究和治療帶來了新的希望。干細(xì)胞不僅可利用神經(jīng)退行性疾病的模型探索其發(fā)病機(jī)制并篩選潛在的藥物，而且細(xì)胞替代治療有望成為新的治療方式。然而，有限的細(xì)胞來源、相關(guān)的倫理問題和免疫排斥反應(yīng)限制了干細(xì)胞的臨床應(yīng)用[3]。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的應(yīng)用可解決這些問題，為PD的治療提供了新的希望。

1 iPSCs的來源

iPSCs是指通過基因重新編排方法，對已成熟分化的細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，得到具有類似胚胎干細(xì)胞的多向分化潛能性細(xì)胞。2006年，首先由Yamanaka等[4]通過在類似胚胎干細(xì)胞(ESC)培養(yǎng)條件下，通過特定的轉(zhuǎn)錄因子，即Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4等四種因子，將分化的小鼠體細(xì)胞重編程為胚胎干細(xì)胞(ESC)樣多能細(xì)胞，即誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。1年后，他們使用2006年文章中描述的四種轉(zhuǎn)錄因子的相同組合從人成纖維細(xì)胞中產(chǎn)生了人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)[5]。自發(fā)現(xiàn)以來，研究者們改變轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入方式，如利用替代載體，或者利用特定的小分子化合物改善并提高了iPSCs的安全性和低重編程率。Matthias等[6]發(fā)現(xiàn)來自小鼠的成纖維細(xì)胞和干細(xì)胞可使用非整合型腺病毒進(jìn)行重編程獲得4種轉(zhuǎn)錄因子。替代載體轉(zhuǎn)座子是一種不含細(xì)菌的DNA且可在細(xì)胞中高表達(dá)，協(xié)助從成人脂肪干細(xì)胞中產(chǎn)生iPSCs[7]。其他替代載體還包括仙臺病毒[8]、質(zhì)粒[9]、RNA[10]和重組蛋白[11]。有研究表明，生物學(xué)試劑5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)可以提高因子誘導(dǎo)的重編程效率。而且BrdU可以替代Yamanaka因子中最重要的Oct4因子，與其他轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)iPSCs產(chǎn)生。且基因突變實驗證實在重編程所使用的濃度下，BrdU并不會導(dǎo)致基因突變及基因組的不穩(wěn)定[12]。深入研究小分子化合物信號通路可更好地理解重編程的調(diào)控信號網(wǎng)絡(luò)，大大推動了iPSCs的研究發(fā)展。

2 iPSCs與PD細(xì)胞模型

PD是一種環(huán)境因素與遺傳因素相結(jié)合的復(fù)雜疾病[13]。近些年來，來自SNCA、LRRK2、PINK1和Parkin突變患者以及攜帶GBA突變的高危人類個體的體細(xì)胞被成功誘導(dǎo)到iPSCs并分化為DA神經(jīng)元[14]。人類把這些分化的DA神經(jīng)元應(yīng)用于研究PD的發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)了PD發(fā)病過程中調(diào)控因子、特殊的病理學(xué)特征、介導(dǎo)過程等等；同時，iPSCs被用于藥物的篩選和再利用。在這些機(jī)制日益清晰的情況下，對人類探索PD的治療藥物及方案有著巨大的幫助。

2.1 LRRK2突變 LRRK2突變是家族性PD最常見的病因。LRRK2的N1437H、R1441C、G2019S等突變在常染色體顯性遺傳的PD患者中均有報道，G2019S是目前最常見的突變[15]。氧化應(yīng)激、SNCA蛋白的積累、自噬溶酶體系統(tǒng)受損、線粒體功能障礙等是PD的病理學(xué)特征[16]。Ho等[17]使用了來自G2019S載體的iPSC衍生的多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞(DAns)，證明mTOR調(diào)控因子亮氨酸-tRNA合成酶(LRS)被LRRK2基因型依賴的方式磷酸化，而G2019S相關(guān)的過度磷酸化與自噬系統(tǒng)受損有關(guān)。

2.2 PINK1突變 PINK1編碼線粒體靶向激酶，可保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞免受應(yīng)激引起的線粒體功能障礙[15]。它與Parkin在線粒體損傷和氧化應(yīng)激中的協(xié)同作用。最近研究表明，PINK1患者來源的DA神經(jīng)元對線粒體應(yīng)激源魚藤酮有著明顯的凋亡傾向和敏感性。研究人員對FDA藥物文庫進(jìn)行表型篩選，發(fā)現(xiàn)貝尼地平(鈣拮抗劑)能有效抑制魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，說明基于iPSCs的細(xì)胞模型是藥物篩選的實用平臺[18]。

2.3 SNCA突變 SNCA基因編碼α-synuclein，也是路易小體的重要組成成分[19]。SNCA三倍體患者中野生型α突觸核蛋白的過度表達(dá)可引起帕金森病的相關(guān)癥狀。α-synuclein在神經(jīng)系統(tǒng)及α-synuclein多聚體在細(xì)胞間傳播的病理學(xué)特征，使得科學(xué)家認(rèn)為降低細(xì)胞中α-synuclein的含量和/或消除細(xì)胞中的毒性α-synuclein可能是減緩、逆轉(zhuǎn)甚至預(yù)防疾病的關(guān)鍵[20，21]。從SNCA三倍體中提取的iPSCs神經(jīng)元也被用于藥物篩選和再利用。Mittal等[22]發(fā)現(xiàn)β2-腎上腺素受體(β2AR)激動劑是SNCA的調(diào)控因子。利用攜帶SNCA三倍體的患者誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞證實了β2AR激動劑可以使SNCA表達(dá)正常化，減少α-synuclein的產(chǎn)生，改善線粒體功能。

2.4 GBA突變 GBA突變可能會影響α-synuclein的形成機(jī)制。Kim等[23]報道：α-synuclein四聚體和相關(guān)多聚體在N370S GBA1帕金森病誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPSC)來源的DAns和攜帶雜合L444P GBA1突變的小鼠神經(jīng)元中均有下降。GBA突變及由于GBA缺乏所致的糖脂鞘類的堆積會引起α-synuclein四聚體的錯誤折疊，產(chǎn)生病態(tài)α-synuclein纖維，使得DAns對毒物的易感性增加。所以維持GBA的活性，避免α-synuclein的錯誤折疊在PD中至關(guān)重要。

2.5 Parkin突變 Parkin基因的表達(dá)產(chǎn)物-parkin蛋白是一種E3泛素蛋白連接酶，在泛素-蛋白水解酶復(fù)合物體通路中起重要作用[24]。Parkin突變失活致其底物在多巴胺神經(jīng)元中異常聚集，產(chǎn)生神經(jīng)毒性，是PD的致病原因[25]。Wang等[26]利用小鼠細(xì)胞實驗和在體實驗證明Syt11是parkin蛋白的底物。Parkin蛋白通過介導(dǎo)Syt11泛素化、蛋白降解，調(diào)節(jié)Syt11在多巴胺神經(jīng)的異常積聚，從而抑制DAns的胞吞、囊泡循環(huán)和DA分泌，引發(fā)PD的病程和DAns的凋亡。

3 iPSCs移植治療PD的應(yīng)用

目前PD治療上主要以緩解癥狀為主，沒有根治的治療方法。臨床上PD的治療主要有藥物治療及手術(shù)治療兩種方式，藥物治療有多巴胺受體激動劑、左旋多巴類制劑、單胺氧化酶 B 抑制劑等等，但僅能改善疾病的癥狀，不能有效地阻止病情的發(fā)展，且長期藥物治療會發(fā)生運(yùn)動并發(fā)癥如運(yùn)動波動和異動[27]。PD的手術(shù)治療主要是 DBS(腦深部電刺激)，主要通過對腦深部特定核團(tuán)的微電流刺激治療運(yùn)動障礙疾病，但也有導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能缺損的風(fēng)險[28]。除了傳統(tǒng)的臨床治療，如藥物和DBS，細(xì)胞替代治療為PD的有效治療策略的開發(fā)提供了一個新的基礎(chǔ)。1987年，Brundin等[29]在瑞典首次將胎兒中腦腹側(cè)組織(fetalventral mesencephalic)移植到PD患者紋狀體中，PD患者的細(xì)胞治療時代開始。

目前細(xì)胞療法在動物實驗中廣泛開展研究。Hallett等[30]在PD模型中對獼猴iPSCs衍生的中腦DA神經(jīng)元進(jìn)行了長達(dá)2年的分析。他們觀察到，單側(cè)植入獼猴iPSCs后，運(yùn)動功能逐漸改善，運(yùn)動活性增加，無需任何免疫抑制。尸檢分析顯示了中腦DAns的存活和移植殼細(xì)胞的廣泛生長。Doi等[31]通過使用底板標(biāo)記物CORIN+對細(xì)胞進(jìn)行分類，iPSCs衍生的DA祖細(xì)胞可以被有效地分離出來。當(dāng)移植到6-OHDA受損的大鼠體內(nèi)時，CORIN+篩選出的DA祖細(xì)胞存活并在體內(nèi)分化為中腦DAns，導(dǎo)致運(yùn)動行為顯著改善，而沒有形成腫瘤。2017年，日本科學(xué)家Kikuchi等[32]在前人的實驗基礎(chǔ)上,分別使用健康人和PD 患者(非基因突變)iPSCs誘導(dǎo)的 DA前體細(xì)胞移植入患有PD的長尾獼猴腦內(nèi),并進(jìn)行了長達(dá)兩年的觀察,發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞成功地在模型猴體內(nèi)存活、增殖并發(fā)揮正常功能，成功緩解了模型猴肢體震顫的癥狀，而且無致瘤現(xiàn)象。現(xiàn)iPSCs移植治療仍在動物實驗階段，相信在不久的將來，會逐步走向臨床試驗。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞具有自我更新的潛能，能夠分化為包括DA神經(jīng)元在內(nèi)的任何體細(xì)胞[33]。此外，iPSCs具有類似于hESCs的特性，但可以由成人細(xì)胞如皮膚、脂肪組織和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生[4]，所以無相關(guān)的倫理問題。自體移植iPSCs也不會產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)的風(fēng)險[33]。

4 iPSCs治療PD存在的挑戰(zhàn)及展望

4.1 年齡因素 許多神經(jīng)退行性疾病都是成人發(fā)病，衰老是PD及相關(guān)神經(jīng)退行性疾病的主要危險因素之一[34]。然而，衰老相關(guān)疾病建模的一個主要障礙是iPSC重編程將代表當(dāng)前捐贈者體細(xì)胞年齡的老化特征重置為iPSC的胚胎階段。年齡相關(guān)的分子特征，如端粒縮短、線粒體功能障礙和細(xì)胞衰老等，不能在iPSC模型中捕捉到[35]。因此，科學(xué)家們嘗試對iPSCs分化的細(xì)胞進(jìn)行人工老化，以建立晚發(fā)性疾病的模型。Colasuonno等[36]通過觀察長期培養(yǎng)的iPSCs發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間通訊的減少、能量代謝改變和自噬發(fā)生。

4.2 iPSCs的定向分化 從iPSCs重編程到多個分化過程的細(xì)胞系的變異性是iPSCs模型的一個障礙[37]。研究表明，iPSCs重編程的變異性主要來源于細(xì)胞的基因組成[38]。Germain等[39]根據(jù)對未分化的iPSCs的轉(zhuǎn)錄組分析，提出了克隆iPSCs結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)的分析方法可以降低特異性，且不會對敏感性產(chǎn)生影響。現(xiàn)已經(jīng)篩選出多種特異性標(biāo)記物如SOX17、FOXA2、CXCR4、GATA4等對多克隆iPSCs進(jìn)行聯(lián)合篩選[40]，可減少克隆的異質(zhì)性。遺傳和表觀遺傳變異可能導(dǎo)致克隆異質(zhì)性和細(xì)胞系之間的功能差異，驗證細(xì)胞克隆及分化過程是患者體細(xì)胞來源的iPSCs應(yīng)用的關(guān)鍵步驟。

4.3 致瘤性 2006年Yamanaka等人經(jīng)典的iPSCs誘導(dǎo)方法中，誘導(dǎo)因子c-Myc本身存在一定的致瘤性[41]；同時，外源的誘導(dǎo)因子基因可插入供體細(xì)胞染色體，從而導(dǎo)致宿主細(xì)胞因染色體修飾、DNA突變而發(fā)生某些基因的關(guān)閉或開放，使獲得的 iPSC有一定的致瘤性。近年來，大量科學(xué)家對iPSCs誘導(dǎo)形成過程進(jìn)行改良，通過改變誘導(dǎo)因子及導(dǎo)入方式、改變重編程方式和定向分化體細(xì)胞、iPSC 分化后檢測及清除腫瘤細(xì)胞等多種方法，為降低及消除iPSCs的致瘤性提供了可能性。

4.4 展望 干細(xì)胞近年來一直是學(xué)術(shù)界研究的熱點，但其涉及倫理、宗教問題等，受到了很大的阻力；iPSCs以其強(qiáng)大的多能性、較少的倫理問題和免疫排斥反應(yīng)，擁有較好的應(yīng)用前景。iPSCs可作為相關(guān)的帕金森細(xì)胞模型，用于藥物篩選、疾病進(jìn)展研究，最重要的是用于移植技術(shù)治療PD。2018年8月日本科學(xué)家Takahashi開展了針對PD的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生細(xì)胞的第一個臨床試驗，招募者為PD中期患者，以移植細(xì)胞分泌多巴胺，刺激大腦紋狀體神經(jīng)元為治療模式[42]。隨著臨床試驗的開展，iPSCs面臨的障礙必將一一掃除，在多巴胺能細(xì)胞再生方面的應(yīng)用必定給PD患者帶來希望。