小鼠腦梗死模型中全腦成像技術(shù)應(yīng)用展望

張?zhí)碓?綜述 逯丹，徐安定 審校

暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 廣州 510632

缺血性腦卒中(ischemic stroke)具有高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率的特點[1]。是由于各種原因引起的腦部血流供應(yīng)障礙，引起局部腦組織的缺血、缺氧性壞死，從而迅速出現(xiàn)相應(yīng)神經(jīng)功能缺損的一類臨床綜合征。越來越多的研究表明，缺血性卒中是中樞神經(jīng)系統(tǒng)整體的病變，即該疾病不單單是局部的神經(jīng)元的壞死，還涉及到遠(yuǎn)隔部位的損害[2]，以及具有代償功能的其他腦組織啟動代償作用[3-4]。但是傳統(tǒng)的切片及成像技術(shù)不能有效地進(jìn)行完整大腦的成像，導(dǎo)致在數(shù)據(jù)采集過程會丟失很多信息，尤其是神經(jīng)連接的信息。為此，完整的器官成像技術(shù)亟需發(fā)展。近年來，顯微光學(xué)切片斷層成像系統(tǒng)(micro-optical sectioning tomography，MOST)以及組織透明技術(shù)(tissue clearing techniques)和lightsheet microscopy系統(tǒng)具備采集和重建更為完整的大腦三維結(jié)構(gòu)，能為研究缺血性卒中在細(xì)胞水平以及神經(jīng)元之間的連接提供更好的技術(shù)支持。

1 小鼠局灶性缺血模型的構(gòu)建

由于小鼠腦血管的解剖特點和人類相似，如存在Willis環(huán)，使小鼠廣泛用于缺血性腦卒中模型的構(gòu)建[5]。常見的模型構(gòu)建方法包括大腦中動脈線栓法(intraluminal thread middle cerebral artery occlusion model)、外科手術(shù)的大腦中動脈阻塞法(surgical middle cerebral artery occlusion models)、光栓塞法模型(photothrombosis model)[6-7]。

盡管小鼠的大腦約為幾厘米，但是傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡和共聚焦顯微鏡不能對鼠腦進(jìn)行直接的完整三維成像。而且傳統(tǒng)的切片技術(shù)費時費力，需要進(jìn)行微米級別的切片以及每張切片的成像，然后將大量的切片整合處理才可能得到完整的鼠腦信息[8]。實際上，計算機斷層掃描(computed tomography，CT)和磁共振(magnetic resonance imaging，MRI)也具備整體的成像，目前在急性缺血性腦卒中患者廣泛應(yīng)用，但是其分辨率過低不能觀察細(xì)胞水平而在小鼠模型的研究中受到了限制[9-11]。為了更好更快的獲得鼠腦完整的三維成像，不同的科學(xué)家們有不同的改進(jìn)，而歸根到底是從兩個基本思路入手：(1)以MOST系統(tǒng)為代表的通過自動化切片同時增加成像速度盡可能地得到鼠腦信息；(2)將組織透明化后直接對鼠腦進(jìn)行“無損”的完整三維成像。

2MOST的系列成像

2010年，中國科學(xué)院團隊開發(fā)了MOST系統(tǒng)并在《Science》雜志上發(fā)表論文：“Micro-optical sectioning tomography to obtain a high-resolution atlas of the mouse brain”[12]。該系統(tǒng)能對大型樣本進(jìn)行直接的自動化成像，通過自動化的切片同時極大提高成像速度實現(xiàn)全腦成像。具體做法是首先通過對全腦進(jìn)行高爾基染色，之后該系統(tǒng)使用金剛石刀具對樹脂包埋組織進(jìn)行切割以使得成像平面較為平整的同時，光學(xué)顯微鏡同步地采集該包埋組織表面信息，最后獲得1 um體素辨率的全腦高爾基染色組織信息。后面由于熒光標(biāo)志熒光成像的需求，出現(xiàn)了熒光顯微光學(xué)斷層成像系統(tǒng)(fMOST)；同時為了降低信號噪比，盡可能地提高信息采集的分辨率，同時加速成像速度等目標(biāo)下，科學(xué)家經(jīng)過多次的反復(fù)改良優(yōu)化，開發(fā)了結(jié)構(gòu)光照明熒光光學(xué)切片斷層成像系統(tǒng)(structured illumination fluorescence micro optical sectioning tomography，SI-fMOST)，該系統(tǒng)增加了雙色成像能力，即同時進(jìn)行雙通道的高通量全腦成像，通過同時采集不同波長、不同發(fā)射特性的熒光標(biāo)志物標(biāo)志，進(jìn)行對比反襯作用，進(jìn)而提高整體的成像分辨率到亞微米級別。同時具備具有天然配準(zhǔn)性能，即每張原始圖像均具備X坐標(biāo)、Y坐標(biāo)和Z坐標(biāo)，能夠進(jìn)行鼠腦的三維信息進(jìn)行重建，從而準(zhǔn)確還原神經(jīng)元在全腦的空間位置[13]。

實際上，MOST系統(tǒng)同樣需要對樣品進(jìn)行切片，會損傷樣品，仍存在丟失部分切片之間信息的風(fēng)險。但較傳統(tǒng)方法而言，該成像方式已經(jīng)可以呈現(xiàn)出更為完整的全腦信息的要求。

3 組織透明技術(shù)和整體成像

在傳統(tǒng)的組織切片過程中，組織器官的完整性遭到破壞，而且切片會破壞特殊結(jié)構(gòu)的連續(xù)性，如在制片過程中會切斷神經(jīng)元的軸突，從而無法得到完整的神經(jīng)纖維[8]。為了追求整個組織器官甚至整個模式動物在顯微鏡進(jìn)行直接成像，生物組織透明技術(shù)蓬勃發(fā)展。大腦等組織器官是由于其含有水、蛋白質(zhì)、脂類等多種不同折光率的多種物質(zhì)，當(dāng)光線通過不同組成成分時會發(fā)生折射、散射等現(xiàn)象，導(dǎo)致光學(xué)觀察受到限制[8，14]。組織透明技術(shù)(tissue clearing)通過各種處理方式對腦組織進(jìn)行折射率的匹配以達(dá)到透明效果，盡可能減少光線在透過腦組織時的吸收和散射，使顯微鏡能采集整體大腦器官的信息，從而更加真實的還原目標(biāo)的三維空間結(jié)構(gòu)[14-15]。

2007年，維也納科技大學(xué)的DODT等[14]通過浸泡苯甲醇和苯甲酸芐酯的混合物(benzyl alcohol-benzyl benzoate，BABB)使鼠腦神經(jīng)網(wǎng)路可視化，并且能清楚觀察到CA1椎體神經(jīng)元的樹突在整個海馬中的形態(tài)。總體來說組織透明技術(shù)的核心是盡可能追求透明化的效果和盡可能減少熒光信號的淬滅。后陸續(xù)出現(xiàn)許多不斷優(yōu)化的組織透明技術(shù)，以3DISCO[8]、iDISCO[16]、uDISCO和FDISCO[17]為代表的方法，該類技術(shù)主要通過有機溶劑對組織樣本進(jìn)行脫水脫脂，再進(jìn)行折射率的匹配得到透明效果，其突出優(yōu)點是透明效果佳、樣品處理簡單、成本較低、時間短，但是熒光淬滅較快也是其突出的缺點。CUBIC、CLARITY在保持熒光強度方面更具優(yōu)勢，其他透明技術(shù)包括Scale、ScaleS、PACT-PARS等方法，每種方法均有其的優(yōu)缺點[15]，使用者可根據(jù)自己的需要選擇相應(yīng)的方法。

當(dāng)組織透明化之后，能容納鼠腦組織的成像系統(tǒng)也很重要，Light-sheet microscopy[14]和Digital Scanned Laser Light Sheet Fluorescence Microscopy(DSLM)[18]能對鼠腦甚至整個小鼠進(jìn)行完整的三維成像。同MOST系統(tǒng)類似，這類顯微鏡系統(tǒng)也在追求高通量信息采集即更快的成像速度以及更高的分辨率。該類成像系統(tǒng)優(yōu)點在于在不損傷樣本的和信息數(shù)據(jù)丟失的同時，具備更為直接的三維成像數(shù)據(jù)采集能力，缺點是分辨率有待進(jìn)一步的提高[14]。

4 整體成像在缺血性卒中的應(yīng)用和展望

4.1 神經(jīng)元連接的示蹤與成像 特定神經(jīng)元之間相互聯(lián)系形成神經(jīng)回路(neural circuit)。除了成像技術(shù)，神經(jīng)元的標(biāo)志也同樣重要。通過神經(jīng)示蹤技術(shù)“點亮”神經(jīng)傳導(dǎo)束形態(tài)，從而顯示出整個神經(jīng)環(huán)路。傳統(tǒng)的神經(jīng)示蹤技術(shù)包括葡聚糖胺(BDAs)、熒光金(fluoro-gold，F(xiàn)G)、固藍(lán)(fast blue，F(xiàn)B)等[19-20]。這類示蹤劑存在許多缺點，包括因無法進(jìn)行特異性標(biāo)志在注射部位局部擴散導(dǎo)致示蹤不準(zhǔn)確，示蹤過程中不能跨突觸或跨突觸的效率不穩(wěn)定，而且信號衰減嚴(yán)重不能進(jìn)行長程示蹤等。而重組病毒載體作為示蹤劑，可以通過選擇不同的病毒特性而進(jìn)行標(biāo)志。而重組的病毒工具主要是通過改造嗜神經(jīng)病毒得到的，根據(jù)感染神經(jīng)元的特性和能否跨突觸傳播，常見的分類代表如下：順行跨多級突觸的單純皰疹病毒(herpes simplex virus，HSV)[21]、逆行跨多級突觸的偽狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)[22-23]，順行跨單級突觸的腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus，AAV)[24]以及逆行跨單級突觸的狂犬病毒(rabies virus，RV)[25]。其優(yōu)勢是能準(zhǔn)確的標(biāo)志神經(jīng)元形態(tài)，跨突觸效率更為穩(wěn)定。

MOST系統(tǒng)以及透明組織后整體成像在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域取得了巨大的進(jìn)步。如通過MOST系統(tǒng)對APP/PS1轉(zhuǎn)基因鼠三維重建，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元樹突在杏仁核(basolateral amygdala，BLA)明顯減少，該腦區(qū)樹突的減少可能是阿爾茲海默病的原因之一[26]；通過腺病毒標(biāo)志神經(jīng)元在MOST系統(tǒng)成像，重建出紋狀體(striatum)-丘腦前內(nèi)側(cè)核(anteromedial thalamic nucleus)-前額葉內(nèi)側(cè)皮層(medial prefrontal cortex，mPFC)環(huán)路以及substantia innominate-anteromedial thalamic nucleus-mPFC環(huán)路[27]；通過肌肉注射rAAV病毒后，經(jīng)過FDISCO使脊髓透明化后，可追蹤支配肌肉的下運動神經(jīng)元在脊髓的逆行投射[28]。

在皮層局灶性腦梗死動物模型中，丘腦、黑質(zhì)等非缺血區(qū)域存在神經(jīng)元、神經(jīng)纖維的丟失，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞如小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞增生[2]。同時，通過深部腦刺激(deep brain stimulation)方法刺激小腦齒狀核，可以通過齒狀核-丘腦-皮層最終作用于皮層，引起突觸新生(synaptogenesis)、突觸可塑性(synaptic plasticity)標(biāo)志物等的增加，有利于運動功能恢復(fù)[3]。提示缺血性腦梗死的功能變化不僅需要關(guān)注導(dǎo)致局部腦缺血引起細(xì)胞壞死的區(qū)域，更重要的是探索在腦梗死病理狀態(tài)下運動、感覺等功能相關(guān)的神經(jīng)回路的改變[29]。因此，選擇合適的病毒工具標(biāo)志神經(jīng)環(huán)路，根據(jù)自己需要通過透明化后成像或直接進(jìn)行MOST系列系統(tǒng)成像，可能更好的揭示神經(jīng)元、神經(jīng)連接等在缺血性卒中后全腦內(nèi)的三維變化。

4.2 全腦血管成像研究 CLARTY在細(xì)胞水平上定位并重建大腦的血管系統(tǒng)的三維結(jié)構(gòu)整體成像[30]；MOST系統(tǒng)同樣可以重建鼠腦的動靜脈的脈管系統(tǒng)在大腦的空間分布[31]，也可獲取腦出血小鼠模型的神經(jīng)血管網(wǎng)絡(luò)(neurovascular networks)信息等[32]。當(dāng)大腦的供血動脈發(fā)生狹窄或堵塞，腦的側(cè)枝循環(huán)會代償達(dá)到缺血區(qū)域，從而使缺血組織得到不同程度的灌注代償。目前許多研究的聚焦于缺血周圍區(qū)新生血管的變化，研究范圍較為局限[33]。但是新生血管是否局限于缺血周圍區(qū)域和代償形式值得進(jìn)一步深究。而且似乎鮮有人研究其他供血腦血管包括Wills環(huán)血管在腦梗死發(fā)生后的整體變化。通過構(gòu)建小鼠缺血性卒中模型，進(jìn)行血管的標(biāo)志后運用上述兩種方式進(jìn)行全腦高分辨率的血管成像，有利于進(jìn)一步揭示在卒中發(fā)生時以及卒中后的整體大腦血管的變化，進(jìn)一步揭示腦血管病的病理生理過程。

4.3 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的整體變化 由于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)不像神經(jīng)元和血管可以追蹤，使得神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在全腦成像似乎沒那么重要。實際上，在發(fā)生缺血性卒中后，缺血區(qū)域、缺血周圍區(qū)域、丘腦、脊髓等多個部位的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞均出現(xiàn)改變[2，34-35]。而且，小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia)和星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte)為代表的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在缺血性卒中后發(fā)揮的功能非常復(fù)雜，比如小膠質(zhì)細(xì)胞在卒中后存在不同極化狀態(tài)可能具備不同功能，星形膠質(zhì)細(xì)胞可能在卒中后不同時期具備損傷或促進(jìn)康復(fù)功能[35-36]。全腦成像無疑利于卒中后膠質(zhì)細(xì)胞變化的研究，比如研究包括膠質(zhì)細(xì)胞在卒中后如何發(fā)生遷移，在中風(fēng)前后同一腦區(qū)以及不同腦區(qū)之間的數(shù)目變化、形態(tài)改變和功能發(fā)揮是否存在差異等。

5 展望

透明化技術(shù)仍在往更簡便、更快捷和透明化效果更好的方向發(fā)展。不管是MOST系統(tǒng)還是透明化后成像方法均有其不足。總體來說，包括成像分辨率仍可以進(jìn)一步提高，成像速度進(jìn)一步加快以及容納更大型的組織標(biāo)本成像等。缺血性腦卒中可以影響很多功能，以運動功能為例子，運動功能的障礙機制可能同時引起包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)與外周器官在內(nèi)的整體變化。因此，未來的挑戰(zhàn)除了關(guān)注于全腦范圍內(nèi)的神經(jīng)血管同時變化，可能還在于如何聯(lián)系中樞神經(jīng)系統(tǒng)和其支配器官在缺血性腦卒中的變化。