慢性阻塞性肺疾病動物模型及評價方法研究進展

林敏聰綜述 張勝軍審校

1.海南醫學院第一臨床學院，海南 海口 570102；2.海南醫學院第一附屬醫院I期臨床研究中心，海南 ?？?570102

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是以持續存在的不完全可逆氣流受限為特點的疾病，呈進行性加重，當肺氣腫和慢性支氣管炎患者出現氣流受限時，就可診斷為COPD。由于擁有較高的發病率及致死率，嚴重影響患者的生活質量，預計到2030年將成為全球第三大死因[1]，造成全球巨大的疾病經濟負擔[2]。慢阻肺病因及發病機制十分復雜，通常是與有害顆粒或氣體對呼吸系統的反應有關，涉及炎癥反應、氧化應激、蛋白酶-抗蛋白酶失衡及免疫機制等[3]，目前仍未完全闡明，因而對這一疾病的治療難以出現突破性進展，目前以對癥治療為主。建立理想的動物模型是研究慢阻肺的基本過程，對于深入了解發病機制有著不可替代的作用，對實現新療法和新藥從臨床前到臨床的轉化更是必不可少[4]。由于動物與人體之間巨大的種屬差異，因此各種模型并不能完全反映人體真實的病變特點，需要根據研究目的選擇合適的動物造模。

1 常用造模動物

動物模型是慢阻肺科研工作的基本條件，但如何構建合理模型亦是難點，理想模型應盡可能模擬出與人類相近的發病機制、病理變化、肺功能改變和癥狀等方面，同時也要具有操作簡易、經濟、方便獲取及可重復性好的條件[5]。目前用于選擇的動物種類繁多，有鼠類、豬、犬、猴子、羊、兔子等[6]，對致病因素的易感性也存在很大差別，根據不同研究方向合理選擇動物造模是研究成敗的關鍵。

1.1 鼠類 小鼠最常用于慢阻肺的建模，具備如下優勢：飼養成本低，易存活，性情溫順，繁殖快一次產代數量多，對基因組的研究已經十分透徹，研發出多種專用的試劑及分子探針，易于進行遺傳操作，有多種有近交品系和遺傳突變體可選擇。局限性：支氣管腺體不發達、無杯狀細胞；缺乏呼吸性細支氣管，難以模擬小氣道阻力升高；氣道管徑小，行氣管滴注藥物和肺功能檢查困難；建模時間較長，停止造模后難以維持穩定的病變，不同品系對各種刺激的反應存在差異[7]。大鼠的優點與小鼠相似，體型較大易于取樣及行肺功能檢查，大鼠呼吸道對有害氣體的抵抗力較強，接受香煙煙霧刺激不容易出現肺氣腫病變，使用頻率不及小鼠。豚鼠也是常用動物，肺部解剖生理與人類相似，易于出現肺氣腫改變，氣道對過敏原的反應也較符合在人類的變化。有研究在香煙暴露10周后就可建立豚鼠模型，通過氣壓全身體積描記法(WBP)評估肺功能時有很多指標與人類相似[8]，但成本較其他鼠類高，缺乏相應的實驗試劑和基因方法的研究，限制了其廣泛應用。

1.2 小型豬 小型豬肺解剖結構與人類相近，也是左二葉右三葉，肺組織發達，便于分區研究，具有呼吸性細支氣管，氣道黏膜下腺體發達，肺部更易出現感染與氣道阻力升高，氣道管徑較大易于氣管滴注藥物和肺功能評價的操作，是較理想的模型。但體型較大，實驗操作較小型動物費時費力，購買和飼養等成本高，不利于開展數量多的研究，生命周期長、繁殖較慢增加研究周期。國內研究者在小型豬氣管內滴注蛋白酶5次，共20周后經肺功能測量能建立早期慢阻肺模型[9]。

1.3 猴子 猴子與人類同屬于靈長類，肺組織部解剖結構、生理功能最接近人類，所具備獨特的優勢用于建立慢阻肺模型最為適合。但涉及高昂的成本和嚴格的倫理保護要求，周期長，操作技術要求高，在實際研究中不作常規推廣，一般在小型動物的臨床前研究中有很大機會轉化到臨床應用才考慮選擇。POLVERINO等[10]在對食蟹猴進行12周的香煙暴露后，出現了氣道炎癥、氣道重塑和高反應性的表現，更符合在人類中的病變特點，但并未發展成肺氣腫，考慮與研究周期有關。

1.4 犬類 犬類也是常用的實驗動物，廣泛用于建立哮喘和慢阻肺等呼吸疾病模型，香煙暴露后可在短時間內產生的肺氣肺，病理改變也與人類較相似，但亦缺少特異性試劑，其余缺點與猴子等大型動物一致。

2 常用造模法

許多因素均可誘發肺部出現慢阻肺的改變，基于發病機制的理論基礎有有多種方法造模，各有優缺點，可單獨或聯合進行，對于選取何種方法主要根據實際研究需要、實驗條件以及不同動物或同種動物不同品系對致病因素的易感性而決定。

2.1 香煙煙霧誘導 吸煙被認為是導致慢阻肺的最主要病因，約90%的慢阻肺患者有長期吸煙史，流行病學調查也證實吸煙者的發病率顯著高于不吸煙者[11]。香煙煙霧(cigarette smoke，CS)中有害的化合物貫穿COPD發生發展的過程，能對呼吸道產生各種損害，因此CS誘導最接近人類的患病過程，是最經典的方法，已成功在多種動物身上試驗得到滿意的結果。CS致慢阻肺機制大致如下：直接損害氣道上皮細胞，使纖毛結構和功能受損，氣道凈化功能下降；刺激黏膜下感受器使支氣管平滑肌痙攣收縮，氣道阻力增加；損傷肺泡上皮細胞及肺血管，活化巨噬細胞和中性粒細胞，釋放各種炎癥介質和彈性蛋白酶，引起氣道重塑和管腔狹窄，彈性纖維破壞，形成肺氣腫[12]。誘導方式有兩種：鼻暴露將管道直接與動物鼻腔相連，即主動吸煙，更加接近人類吸煙的實際情況。全身暴露將整只動物置于煙熏箱中，即被動吸煙，操作更為方便應用較多。方法無統一標準，各種方法的暴露時間、頻率、香煙用量及品牌都不盡相同，實驗結果往往有差異，該法誘導時間較長，隨著時間的延長，肺部病變就越嚴重。BECKETT等[13]將小鼠在CS暴露僅在8周就出現出現了慢阻肺的多種改變。張蘭英等[14]發現在小鼠中煙熏4周后支氣管肺泡灌洗液(BALF)蛋白含量、肺泡直徑、肺病理切片與煙熏2周相比有顯著差異，符合COPD的改變，停止造模后各項指標穩定，表明4周小鼠能建立穩定的模型。

2.2 脂多糖誘導 脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性細菌的細胞壁成分，在CS和污染空氣中亦存在，屬內毒素，能刺激內皮細胞、單核細胞、中性粒細胞等釋放炎性介質介導一系列反應，引起蛋白酶-抗蛋白酶失衡，破壞肺組織結構，導致肺氣腫發生。通常采用氣管內滴注的方法，操作簡便，造模時間短[15]，可模擬急性加重反應，但不能模擬慢性病變的過程，只能復制出慢阻肺的部分病理特征，一般與其他方法互補結合。

2.3 蛋白酶誘導 基于蛋白酶-抗蛋白酶失衡理論，蛋白酶分泌增加或活性增強、抗蛋白酶生成減少或受抑制不足以對抗蛋白酶的破壞作用，導致肺內纖維蛋白、彈性蛋白和膠原纖維分解，肺彈性回縮力減弱，形成肺氣腫。有害氣體刺激、氧化應激、先天性抗蛋白酶缺乏等均會破壞這種平衡。常用的有豬胰蛋白酶、中性粒細胞彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶等，給藥途徑有氣管內滴注、霧化吸入、靜脈注射。氣管內滴注最常用，不僅能免受血液中滅活因素的影響，而且易于控制劑量和復制出嚴重的病變。此方法具有造模時間短、成本低、易于操作的優點，誘導的全小葉型肺氣腫可與CS誘導的小葉中央型肺氣腫互補，一般在1個月左右就可出現。一項在C57Bl/J6雌性小鼠中鼻內滴注彈性蛋白酶的研究中，共3次，21 d后就可出現肺氣腫[16]，與CS誘導相比大幅度縮短研究周期。

2.4 基因調控模型 并非所有吸煙人群均可發展為COPD，除環境因素外，遺傳因素也參與慢阻肺的發病[17]，攜帶易感基因的動物也更易罹患慢阻肺。基因模型能更準確地了解易感基因的致病機制，因此在慢阻肺的研究中發揮日益重要的作用。此法穩定性和重復性好，可用于特異性靶點篩選的研究，但獲取過程周期較長，操作復雜技術要求高。獲取方式有自然變異、轉基因和基因敲除，機制大致是通過影響基因表達對肺組織生長發育、結構等產生影響。小鼠攜帶緊皮、蒼白、米色、斑點基因型的自然突變品系能夠自發產生肺氣腫[18]。將目的基因插入基因組中使之出現持續和活躍表達相關產物即轉基因模型，需注意影響其他基因表達的可能性，目前已制備MMP-1、胎盤生長因子(PLGF)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白介素-13(IL-13)、干擾素γ(IFN-γ)等過表達模型。嵌入外源性DNA使特定基因功能缺失而研究對生物體的影響，所得到的就是基因敲除動物，但可能存在基因重疊或基因失活的致命影響，最經典的就是α1-抗胰蛋白酶(ATT缺乏可引起肺氣腫，目前已通過CRISPR技術敲除小鼠所有編碼AAT的基因制備這類模型，還有血小板源性生長因子-A(PDGF-A)、腺苷脫氨酶、表面活性蛋白D(SP-D)等敲除突變體[19]。

2.5 免疫模型 患者肺內存在活化的Th1細胞、B淋巴細胞、CD8+T細胞，在戒煙后肺部炎癥還可長期持續，說明自身免疫機制參與慢阻肺發病過程[20]。患者的IgG和IgA抗支氣管上皮細胞循環抗體(anti-HBEC)和細胞角蛋白18(CK18)、CK19自身抗體增加，表明自身免疫與慢阻肺嚴重程度有相關性[21-22]。實驗已建立起大鼠自身免疫肺氣腫模型，機制目前尚不清楚，有待進一步研究。

2.6 其他方法誘導模型 污染空氣中的多種物質均能對肺部產生不同程度影響，如SO2、PM2.5、臭氧均與慢阻肺的發病有關。SO2能使肺組織產生炎癥反應，損傷肺泡上皮細胞，很早已建立相應模型。慢阻肺患者下呼吸道中存在多種定植菌，可引發慢性炎癥致氣道重塑、管腔狹窄等改變，有研究者通過銅綠假單胞菌感染大鼠建立COPD模型[23]。細顆粒也出現類似香煙煙霧的作用，刺激呼吸道黏膜，減弱氣道凈化能力，已用吸入PM2.5和氣管滴注混懸液建立起典型COPD病理改變的模型[24]。臭氧是常見的空氣污染物，與多種呼吸系統疾病的發生有關，SUN等[25]將小鼠暴露2.5ppm濃度臭氧中7周，每周2次就可建立起較理想的模型。

2.7 多因素誘導模型 由于發病機制和病因的復雜性，單一因素造模只能復制一部分病變，為盡可能重現多方面的病理和功能改變，采用復合因素建模更合理。常用是有CS聯合LPS誘導、CS與基因模型結合、LPS與細菌感染結合等。國內一項在大鼠中比較煙熏法、LSP滴入法和兩種方法聯合的研究中，各造模28 d就可出現病理改變，但聯合造模法病理評分和MMP-9、TGF-β1變化更顯著[26]。

3 評價方法

如何評價實驗動物是否造模成功、符合研究要求是一個很重要的方面，理想模型應盡量與人類常見的病因符合、病理特點和功能改變相近，物種的差異性使評價指標無法完全達標，目前仍然無統一的規范化標準，常用有肺功能、病理學、血氣分析等檢查[27]，根據動物特性可通過多方面綜合評價。

3.1 一般情況 COPD是一種全身性疾病，造模過程中大多數動物能逐漸出現不同程度的咳嗽、噴嚏、鼻分泌物增加、呼吸急促、飲食減少、體質量減輕、毛發枯黃脫落、活動減少、精神倦怠等癥狀。一般情況可作為初步的評價指標，有重要的參考價值，決定實驗動物能否進行下一項的評判過程。

3.2 病理改變 病理檢查能直觀的顯示氣道和肺組織的結構變化，評價病變嚴重程度，提供動物造模是否符合要求最有力的證據。從整體上看病肺體積增大、腫脹、顏色變淺和彈性下降等。病理切片光鏡觀察顯示氣道黏膜下腺體肥大增生、杯狀細胞增多；黏膜下炎性細胞浸潤；上皮細胞壞死脫落、出現鱗狀化生；終末支氣管出現管壁增厚、管腔變形狹窄、可見分泌物阻塞；管周和肺間質炎細胞浸潤；肺泡管、肺泡囊和肺泡明顯擴大、結構紊亂，肺泡壁變薄、斷裂而部分融合成肺大皰[28]。

3.3 肺功能檢查 慢阻肺具有早期小氣道阻塞的特點，臨床上通常用肺功能檢查作為診斷的金標準，是檢測是否存在氣流受限的重要手段。COPD的肺總量(TLC)和殘氣量(RV)增加，肺活量(VC)、用力肺活量(FVC)、第一秒用力呼氣容積(FEV1)、FEV1占預計值百分比(FEV1%)、肺動態順應性均下降，FEV1/FVC＜70%就認為存在氣流受限。常用的檢查方法有體描法、脈沖震蕩法(IOS)。體描法受氣體溫濕度、收縮狀態、呼吸頻率等多因素影響，逐漸被IOS法取代。IOS法是基于強迫震蕩技術發展的最常用的方法，應用此原理的Flexivent技術能具有快速、準確、操作簡便、重復性好的優點，能測定多種呼吸動力參數。

3.4 炎性細胞 慢阻肺的支氣管和肺組織出現多種炎性細胞浸潤，可作為模型評價的有用指標[29]。中性粒細胞是COPD主要的炎性細胞，其活化和聚集是炎癥過程的重要環節，炎癥存在時大量聚集，并分泌-IFN-γ，IL-8，趨化更多中性粒細胞聚集，釋放活性氧(ROS)和彈性蛋白酶、基質金屬蛋白酶引起氧化應激及破壞肺組織[30]。巨噬細胞是呼吸系統的防御細胞，炎癥存在時也可釋放趨化因子，在患肺中能大量增加，加重炎癥反應。肺中CD8+T淋巴細胞數量的增加與氣流受限程度相關，分泌集落刺激因子、IFN-γ、IL-2、IL-4、顆粒酶B等調節巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞功能而加重氣道慢性炎癥。

3.5 細胞因子 各種細胞因子的變化水平在慢阻肺初期即可表現出來，對早期評估和診斷有著重要的價值。典型的細胞因子有IL-8、IL-4、IL-10、TNF-α、IL-1β、IFN-γ、α1-AT。IL-8由巨噬細胞和上皮細胞所分泌，對中性粒細胞有趨化和激活作用、促進炎癥發生發展和組織損傷，在疾病發展各階段都發揮作用，可用來判斷病情嚴重程度。IL-10是一種炎癥和免疫抑制因子，在病情進展過程中其水平降低，也可用于病情評估。TNF-α主要由單核-巨噬細胞分泌，能活化自身和T淋巴細胞，并刺激中性粒細胞釋放IL-8。轉化生長因子-β1(TGF-β1)可通過刺激細胞外基質和纖維合成參與氣道重塑過程[31]?；|金屬蛋白酶-9(MMP-9)則能分解細胞外基質和基底膜，調節其他細胞因子活性、降解ATT，參與肺組織破壞及重塑，吸煙量與肺內的MMP-9正相關而與FEV1呈負相關[32]。近年來發現IL-18是一種重要的促炎因子[33]，促進慢阻肺的穩定發展，有望成為新療法的靶點。

4 結語

動物模型的建立是探索疾病預防、新藥研發和新療法的基礎，使臨床研究能夠順利、安全地開展，是實驗室研究成果轉化到臨床應用的必不可少的環節。目前還沒能建立起完全符合人類COPD病變特點的最理想模型，且沒有統一的標準[34]，目前也在不斷尋找更適合動物和造模方法，以求達到一種規范化。近年來比較流行的雪貂煙熏模型[35]，其氣道生理學與黏膜下腺體分布于人類高度相似，氣道阻塞程度較其他動物嚴重，有較多自發性咳嗽，造模6個月后顯示出與人類很多相似特點，有望成為一種理想的動物模型。CS誘導的小鼠模型中miRNA-21水平比對照組高，表明與疾病嚴重程度有關，水平降低可對COPD的發展有抑制作用，可作為一種全新的評價指標[36]。目前多應用復合因素造模更符合COPD發病機制復雜的條件，根據研究目的和實驗條件選擇合適的動物和造模方法是保證造模成功和研究過程順利開展的前提。需要多方面標準評價模型是否達到要求，確定存在典型病理改變、通氣受限、動態順應性下降等改變。隨著技術方法的不斷改進，將會出現更理想的動物模型和更全面的評價方法，為進一步研究COPD提供有力的支持。