PD-L1相關作用機制及其在腫瘤中的研究進展

陳文生 綜述 趙穎海 審校

廣東醫科大學病理系，廣東 湛江 524023

程序死亡分子蛋白1(programmed death-1)是由ISHIDA等[1]在1992年通過消減法技術中發現的。其廣泛存在于各類淋巴及巨噬細胞表面，而在活化的T淋巴細胞的表面因子也是近年來的研究熱點。在正常情況下，T細胞是人體內重要的細胞免疫細胞，可以識別和殺傷細菌、病毒以及人體內失去調控變異細胞等功能。而與其相對應的程序性死亡蛋白配體1(programmed cell death 1 ligand 1，也稱 PD-L1)是由DONG等[2]從胎盤基因文庫中發現。PD-L1屬于B7家族，主要存在于胎盤、肺、心、肝及免疫器官，其他正常組織經過誘導也能表達，其主要作用是調節人體免疫功能。當PD-L1與T細胞中PD-1蛋白配對結合時，就會使得免疫細胞失去攻擊能力，以此保護正常組織。腫瘤細胞正充分利用其特性，通過誘導后其表面PD-L1表達功能上調從而直接或間接抑制機體內的T細胞對自身免疫殺傷癌細胞功能，進而成為導致腫瘤的免疫逃逸重要原因之一[3]。因此PD-1與PD-L1研究有望成為腫瘤免疫治療的重要手段。現對PD-1/PD-L1的相關作用機制及目前腫瘤治療的相關進展進行綜述。

1 PD-L1/PD-L2分子機制

PD-L1(B7-H1)和 PD-L2(B7-DC)均為 B7同系物，并由位于染色體9 p24.1上的CD274基因編碼，其已均被證實為受體PD-1的配體[2，4]。在機體中，其在不同組織中差異性表達，但主要在T和B淋巴細胞、樹突狀細胞(DC)、單核細胞、間充質干細胞(MSC)、骨髓(BM)產生的肥大細胞及各種免疫器官中表達[5-6]，此外部分細胞經誘導后均可表達PD-L1，如IL-21可誘導CD19+B細胞表達PD-L1，γ鏈細胞因子可誘導T細胞表達PD-L1[2]，以及干擾素(IFN)-γ可誘導激活非淋巴細胞上的PD-L1表達，如內皮細胞、單核細胞等[8]。相關研究表明PD-L1在細胞區室中也廣泛存在[9]，包括存在于細胞膜之中的PD-L1(mPD-L1)，還包括細胞質中的PD-L1(cPD-L1)、核中的PD-L1(nPD-L1)、血清中的PD-L1(sPD-L1)和外泌體中的PD-L1[9-14]。而在PD-L1 mRNA的表達中，CD274基因產生了兩個可供選擇的轉錄本。通過對約800個堿基序列(bp)進行測序，發現其分子量為33 kDa，編碼290個氨基酸。PD-L1是一種跨膜糖蛋白，由一個包含免疫球蛋白(Ig)樣結構域的大胞外區域、一個疏水跨膜結構域以及30個氨基酸的胞質尾部組成，不包含典型的信號基序[15]。此外，PD-L1啟動子具有約220 bp的CpG甲基化位點，研究表明其可控制表觀遺傳[16]。PD-L2是PD1的第二配體，其與PD-L1大約有22%氨基酸同源[17]。與PD-L1相比，PD-L2的表達非常局限于活化的樹突狀細胞、巨噬細胞、BM來源的肥大細胞和腹膜B1細胞[18]。LPS和BCR可誘導B細胞表達PD-L2，GM-CSF和IL-4可誘導dc表達PD-L2[17]。這兩種PD-1配體在惡性腫瘤上都有被發現，但與PD-L1相比，PD-L2的表達程度較低[19]。

2 PD-1/PD-L1介導的信號轉導

PD-1與PD-L1的相互作用在維持免疫系統與抗腫瘤免疫反應之間的平衡發揮關鍵性作用。PD-1通過產生與T細胞的受體(TCR)和CD28共同相互抑制的微團簇，然后通過利用其在細胞上的組織相容的特性與抗原PD-L1相識別后激活原始T細胞，激活相關信號最終抑制細胞中葡萄糖的消耗、細胞因子的大量產生、T淋巴細胞的增殖和存活，此外它進一步阻止了包括與GATA-3、T-bet和Eomes在內的effector功能相關的TF表達[20]。因此其通過抑制T細胞介導的免疫反應，在炎癥及腫瘤細胞的免疫反應中同樣具有抑制作用。在腫瘤的微環境之中，PD-1通過TCR下游的信號可以活化T細胞表面表達，它在與配體PD-L1結合后通過傳遞抑制信號以調節T細胞活化，PD-1連接減弱了TCR介導的信號傳導，并直接損害PI3 K-Akt和Ras/MEK/ERK途徑的活性[21]，因此，PD-1介導的抑制途徑與降低T細胞增殖、促進T細胞凋亡、導致T細胞衰竭密切相關。此外，PD-1與配體PD-L1相互結合導致CD3、ZAP70和蛋白激酶C的磷酸化降低，抑制T細胞 ERK活化，抑制 B細胞Igβ、Syk、PLC-γ2和ERK的鈣動員和磷酸化[22-23]。不同細胞類型的PD-1與PD-L1結合有不同的功能。在影響T細胞中，PD-1通過多種方式抑制其活性，例如通過影響細胞周期、增殖、存活和細胞因子產生的多種調節因子來抑制細胞周期的進展。此外，PD-1還參與TGF-β介導的信號轉導，促進其增殖。Ras-PD-1調節SWAT3并與TGF-β介導的信號協同作用[24]。其次，PD-1改變了活化的T細胞的代謝過程，從而產生更多的氧化微環境。關于PD-1信號轉導途徑已得到很好的認知，但其信號轉導在腫瘤免疫治療方面所面臨的問題仍是當今的研究熱點。

3 PD-1/PD-L1與腫瘤的免疫逃逸

腫瘤通過多種途徑抑制損害腫瘤特異性免疫細胞、T細胞、巨噬細胞和其他與免疫應答相關的細胞的功能，從而導致腫瘤免疫逃逸，這些途徑主要包括：促進T細胞表面抑制受體表達和抑制T細胞刺激性受體如T細胞受體(TCR)/CD3和CD28，通過聚集免疫抑制白細胞，逃避免疫的監控，從而為腫瘤細胞創造了一個可以阻止抗腫瘤免疫反應的微環境，包括抗原提呈細胞的缺陷、抑制細胞負性免疫調節和有缺陷的抗腫瘤T細胞。PD-1作為一種免疫抑制分子的受體，可阻止人類T淋巴細胞的增殖和活化，在免疫逃逸中發揮重要作用。PD-1/PD-L1信號通路相互作用導致腫瘤的免疫逃逸是目前的研究熱點也是研究的難點，目前尚未完全闡釋清楚，但是目前研究結果表明可能與以下幾個方面密切相關，(1)PD-1/PD-L1相互作用激活一種亦可抑制TCR介導的T細胞活化和增殖的信號，也可抑制干擾素-γ(IFN-γ)和白細胞介素-2等細胞因子的分泌，從而促進細胞毒性T細胞凋亡和調節性T細胞分化[25]。(2)PD-L1促進腫瘤基質上皮細胞的間質化：上皮細胞間質化(EMT)是指上皮細胞在機體各種刺激下誘導上皮細胞向間質細胞的轉變。在腫瘤的整個發生發展的過程中均可由EMT，從而促進腫瘤細胞的惡化性轉變。CAO等[26]研究結果發現PD-L1一方面可導致腫瘤細胞中Twist和Slug的表達上調，另一方便可抑制E-cadherin的表達，誘導上皮細胞間質化，從而導致腫瘤細胞出現免疫逃逸，促進腫瘤進一步惡化。(3)許多參與T細胞活化的途徑，包括主要組織相容性復合體(MHC)-TCR-ZAP70-RAS-GTPase(RAS)-ERK和CD80-CD28-PI3 K蛋白激酶B(AKT)途徑等均受PD-1/PD-L1相互作用的調節[27]。因此PD-1/PD-L1信號通路對腫瘤免疫逃逸起著重要地位，而且這也是近年來PD-L/PD-L1作為免疫治療重要的理論依據所在。

4 PD-1/PD-L1的表達調控

PD-L1的表達受多種腫瘤微環境的局部刺激信號和T淋巴細胞產生的干擾素(IFN)-γ誘導，有相關研究表明，NF-κB途徑可以抑制和損害IFN-γ介導的PD-L1誘導表達[28]，研究人員發現使用NF-κB抑制劑同時也會導致PD-L1的表達下降。此外，腫瘤細胞在腫瘤微環境中表達PD-L1控制的刺激信號。許多炎性細胞因子可誘導PD-L1的表達。尤其是DC中的IL-1β、IL-6、IL-27、IL-10等[29]。致癌轉錄因子MYC在許多癌細胞中高表達。相關研究發現MYC可以與PD-L1的啟動子相結合，可降低PD-L1的表達[30]。

腫瘤內基因突變、擴增與PD-L1的調控相關，由于PD-L1位于9 p24.1號染色體基因編碼上，因此9 p24.1區域的擴增與多種癌癥中PD-L1水平的升高密切相關[2，4]。而最近研究發現在三陰性乳腺癌中PD-L1的DNA拷貝數改變(CNAs)頻率增高，其可直接導致PD-L1的表達增加[31]。

PD-L1的表達受腫瘤內的表觀遺傳改變而改變，如啟動子DNA的甲基化、組蛋白修飾和microRNAs中在不改變遺傳信息的情況下調節對DNA成分的識別和結合因素與轉錄因子，從而調節PD-L1的表達。PD-L1啟動子的高甲基化與PD-L1的低表達密切相關。研究人員發現CD274啟動子的高度甲基化可導致PD-L1表達下調/缺失[32]。而在許多癌癥中均曾被報道過存在PD-L1啟動子甲基化的現象，因此PD-L1啟動子甲基化可能對腫瘤患者預測PD-1/PD-L1免疫治療的療效具有重要的臨床意義。此外在組蛋白修飾相關修飾方面，包括磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化和ADP核糖化，也都可以調節PD-L1基因表達，非糖基化的PD-L1磷酸化后泛素-蛋白酶體系統可以降解。因此，針對PD-L1多泛素化可能是增強免疫檢查點治療的一種途徑，PD-L1可在表皮生長因子上受到乙酰化酪氨酸磷酸化和單泛素化作用刺激，糖基化可導致PD-L1在腫瘤細胞中的表達穩定，包括腫瘤干細胞長蛋白半衰期，與逃腫瘤避免疫監視有關[17]。因此組蛋白修飾可能影響PD-L1介導的免疫抵抗，并可能成為增強的潛在靶點抗腫瘤免疫反應。作用于PD-L1的miRNA是含有約20個核苷酸的非編碼單鏈RNA，最近研究表明miRNAs可以直接或間接調節PD-L1具有免疫調節潛能[33]。在某些情況下，靶向miRNA可使PD-L1表達下調，導致抑制腫瘤生長、侵襲以及增強T細胞反應和降低化療耐藥性有關。但也有部分miRNA可使PD-L1表達上調，從而導致相反的作用。研究發現在不同的小鼠模型實驗中發現了靶向PD-L1的3'非翻譯區的miRNAs如：miR-34、miR-200、miR-138和miR-570，導致 PD-L1表達下調[34]。但也有研究發現部分miRNA如：MiR-20、MiR-21和MiR-130b通過抑制抑癌基因(PTEN)的表達，間接導致PD-L1表達上調[35]。

PD-L1的表達受腫瘤內轉錄因子的調控。轉錄因子AP-1是由c-Jun、FOS、MAF或ATF組成的二聚體復合物。最近研究發現在霍奇金淋巴瘤中，PD-L1可通過AP-1與第一內含子的增強區相結合而誘導表達[36]。轉錄因子STAT3也參與調節PD-L1表達。DURAND等[37]研究發現在T細胞淋巴瘤中，STAT3通過與PD-L1啟動子結合可導致PD-L1的表達上調，相反通過抑制STAT3可以導致PD-L1的表達下調。HIF-1α是非常重要的致癌因子，NOMAN等[38]研究發現缺氧誘導因子1α(HIF-1α)與 PD-L1近端啟動子的結合刺激PD-L1的轉錄，因此HIF-1α的過度表達導致PD-L1的表達上調。此外，轉錄因子MYC在許多腫瘤細胞表達并參與腫瘤整個的發生、發展過程。但是MYC對PD-L1的調控仍不明確。部分研究報道發現腫瘤細胞中的MYC與PD-L1啟動子結合導致PD-L1的表達下調，從而增強腫瘤的免疫殺傷能力[39]，但仍有部分研究者發現MYC轉錄因子通過其在腫瘤發生、發展和維持中的致病作用直接促進腫瘤的惡性轉化[40]。

5 PD-1/PD-L1免疫治療及耐藥性研究進展

正是由于PD-1/PD-L1具有上述特點，因此其為當今世界開啟了腫瘤免疫治療的新時代，也使得腫瘤免疫治療成為當今研究熱點，其目的就是消除腫瘤的免疫逃逸，增強腫瘤的免疫效應從而達到高效、特異的治療癌癥。而經過近年來許多專家和學者的努力，PD-1/PD-L1免疫治療在許多癌癥治療當中如惡行黑色素瘤、淋巴瘤、肝癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、尿路上皮癌等均取得明顯療效。目前已被FDA批準分為兩類，一類是阻斷PD-1/PD-L1軸PD-1抗體如單抗帕博利珠單抗(pembrolizumab)、納武利尤單抗(nivolumab)、cemiplimab，另一類是抗 PD-L1單抗atezolizumab、durvalumab和avelumab。雖然PD-1/PD-L1免疫治療因個體的異質性，所以其療效有較大差距，但其對比未使用免疫治療劑的生存率有了明顯提升，因此PD-1/PD-L1的異質性也是當今的難點與熱點。而在PD-1/PD-L1免疫治療的過程中，人們發現免疫治療的耐藥性也是當今仍未解決難點，而關于其免疫治療耐藥機制尚未完全清楚，但目前研究發現與以下幾種機制有著密切關系，(1)腫瘤抗原表達缺失：腫瘤突變負擔(TMB)為每百萬基因突變包括編碼錯誤、中排、插入、缺失等的總數[41]，而每當基因突變數增加時會產生更多新抗原，從而導致腫瘤被特異性T細胞攻擊，增加了對PD-L1治療的敏感性。因此高水平的TMB可導致PD-L1阻斷敏感、低水平的TMB導致較低的免疫原性使得治療效果差。(2)缺乏有效的抗原提呈細胞(APCs)：APCs是一類將抗原處理后并將其處理后層遞給T細胞，然后T細胞發揮免疫反應，因此APCs在免疫治療環節中起著很重要作用。其中樹突狀細胞(DC)是一類非常重要的人體抗原提呈細胞，人體DCs大多處于未成熟的狀態，未成熟的DCs細胞具有較強的抗原性吞噬能力。在抗原刺激下，未成熟DCs可以分化為成熟DCs，成熟的DCs能夠表達高水平的共刺激和抑制因子，在成熟過程中，樹突狀細胞從外周組織遷移到次級淋巴器官，與T細胞接觸，刺激細胞免疫反應。DCs是目前發現的最有效APCs，能夠影響特異性的細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)的產生。同時腫瘤微環境能影響DCs的分布、分化與成熟[42]。(3)腸道菌群可以影響腫瘤發展和PD-1/PD-L1免疫治療的效果：研究發現雙桿菌可以刺激DCs，誘導其成熟，促進細胞毒性T細胞的激活和PD-1/PD-L1阻斷的增加，從而增強機體的免疫反應[43]。(4)T細胞趨化因子：能夠將免疫細胞吸引到特定部位，一方面，腫瘤和腫瘤組織中 的 基 質 細 胞 招 募 CXCL9、CXCL10、CXCL11、CCL3、CCL4、CCL5等趨化因子來招募NK細胞和ctl引起腫瘤反應；另一方面，腫瘤微環境中高水平的趨化因子如CCL2和 CCL22，通過招募 MDSCs、Tregs、m2等免疫相關抑制細胞來抑制免疫應答[44]。(5)參與腫瘤發生、發展過程中的各種信號轉導通路：如PI3 K-AKT-mTOR參與細胞生存、增殖和分化等重要的細胞過程，MAPK途徑的激活許多不同的細胞過程，如增殖、分化、運動、凋亡和存活，IFN-γ可上調MHC分子和PD-L1的表達，從而增強腫瘤抗原的遞呈和對PD-1治療的反應等。正因為目前PD-1/PD-L1免疫治療的局限性，因此結合其他療法如放療、化療等綜合性治療也成了當今重點發展方向。

6 展望

雖然PD-1/PD-L1的表達在許多不同來源的腫瘤均已得到證實并且與腫瘤的免疫逃逸有著密不可分的關系，但其作為治療預后生物標志物的價值和免疫治療利用的效率仍存在爭議。因此，為了更好的利用它們的特性，仍需要更加深入的去了解其分子機制、信號轉導、表達調控等各方面，才能更好突破PD-1/PD-L1在臨床免疫治療的局限性，為腫瘤診治開辟新的方向。