基因編輯技術在人參中的應用展望

王琪，張浩，王博文，雷秀娟，王英平,※

（1.中國農業科學院特產研究所，吉林 長春 130112；2.吉林農業大學，吉林 長春 130118）

基因編輯技術是近幾年蓬勃發展的一項新型生物技術，不同于傳統轉基因技術的隨機性與不確定性，該技術能對基因組進行定點修飾。在特定位置斷裂核酸分子后，基于細胞的自我修復機制，以非同源末端修復和同源重組途徑實現堿基的缺失、替換，基因的敲除、敲入等進而達到對基因的編輯目的[1]。基因編輯技術自問世以來已廣泛應用于各類基礎研究和生產應用，如基因組功能研究、動植物育種、基因治療和遺傳性狀改良等領域且成果顯著。目前基因編輯技術已在模式植物和農作物中發揮了巨大的作用，體系日漸成熟和完善，但藥用植物道地性強、數量相對稀少和研究范圍較窄的現狀在一定程度上制約了基因編輯技術在藥用植物領域的應用和發展[2]。藥用植物基因編輯體系的建立必定是一個較為漫長且艱難的歷程。

人參是藥用植物家族中的重要一員，被譽為“百草之王”，喜陰涼濕潤的環境，主要分布在我國東北三省，同時也在朝鮮北部、日本中北部和韓國中部等臨近中國的山區地帶有所分布[3]。人參具有補氣安神、益肺益智、大補元氣和補脾生津等功效[4]，除了因極具藥用價值而得到醫學藥學界的認可外，人參還被應用于保健和藥妝等領域。但目前仍有許多因素限制著人參產業的進一步發展，如人參道地性強，對生存環境要求嚴格；生長年限長，易遭受病蟲害；主要有效成分人參皂苷在植物本體內的含量并不高且難以達到大規模的產業化等。隨著分子生物學手段的不斷更新和完善，越來越多的研究人員致力于從基因層面對物種進行直接調控。雖然目前對人參基因組的研究不夠全面和深入，但基因編輯技術可以推進藥用植物基因組的功能研究，反之人參基因功能研究的完善也會加快基因編輯技術在人參中的發展。建立起人參基因編輯的相關體系，將對人參的遺傳分析、種質創新和品質改良具有重大意義。

1 基因編輯技術

基因編輯技術的發展主要經歷了人工核酸酶介導的鋅指核酸酶（ZFN）技術、類轉錄激活因子核酸酶（TALEN）技術和規律成簇間隔短回文重復序列（CRISPR）技術。它們能特異性地識別靶位點，對其單鏈或雙鏈進行精準切割造成鏈的斷裂，啟動生物體的內源性修復機制來完成對靶標基因的敲除乃至替換。尤其是CRISPR/Cas 系統以其靈活的試驗設計、低成本和短周期迅速引領了基因編輯的潮流，同時科研人員進行了大量基于CRISPR/Cas9 的技術優化以期實現更高效的基因編輯。

1.1 鋅指核酸酶（ZFN）技術

鋅指蛋白是1983 年在非洲爪蟾的TFA 家族中發現的一類轉錄因子。每個鋅指蛋白可以特異性地識別DNA 鏈上的3 個連續堿基，把3～6 個鋅指蛋白串聯成結構域，便可識別更多的堿基及序列[5]，且具有較高的特異性。FokI 是在海床黃桿菌中發現的一類限制性內切酶，只有在形成二聚體的前提下才能發揮其切割作用。1996 年，Kim 和Cha 兩位科學家將鋅指結構與FokI 的酶解中心串聯起來，得到了鋅指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）[6]，經人工改造后能夠實現基因的定點編輯。把鋅指蛋白結構域和不同的酶、轉錄因子相結合就能形成具有特異性功能的蛋白復合體，發揮不同的作用。目前已經得到廣泛應用的有鋅指核酸甲基化酶（ZFM）、鋅指激活因子（ZFA）、鋅指抑制因子（ZFR）以及鋅指核酸酶（ZFN）等[7]。ZFN 介導的基因編輯技術已得到廣泛應用。Osakabe 等[8]用鋅指核酸酶對擬南芥ABI4 基因進行編輯，所獲得的純和植株對葡萄糖、脫落酸的敏感度降低；Li 等[9]通過ZFN 對B型小鼠進行基因編輯治愈了血友病并獲得具遺傳性狀的個體；Cai 等[10]利用ZFN 對煙草CHN50 基因進行編輯，啟動細胞內的同源重組修復途徑，成功將外源基因PAT 整合到靶序列中。

1.2 類轉錄激活因子核酸酶（TALENs）技術

類轉錄激活因子效應物（transcription activator-like effector,TALE）是在植物病原菌黃單胞菌屬（Xanthomonas）中首先被發現的一種相對保守的菌體蛋白[8]，由其T3S（type secretion system）分泌，侵染細胞后可以特異性地識別植物的DNA 序列[11]，模擬宿主行為激活靶基因的轉錄并從基因層面對植株進行調控。TALE 蛋白DNA 結構域第12 和13 位的氨基酸協同作用組成一個識別單元（repeat variable diresidues，RVD），每個RVD能特異性識別某種堿基[12]。研究人員把TALE 的識別結合域和FokI 的DNA 切割域相互融合，成功構造出能識別并切割DNA 雙鏈的特異性核酸內切酶（TALENs）。TALENs 在植物育種、基因治療和遺傳改良等領域皆取得了顯著成效。Shan 等[13]通過該技術對控制水稻香味的OsBADH2 基因進行敲除獲得了香味株系并在此基礎上成功培育了香稻品種；Bacman 等[14]利用TALENs 成功實現線粒體的基因編輯，為線粒體病的基因治療開辟了新途徑；Haun 等[15]對調控大豆脂肪酸的FAD2-1a、FAD2-1b基因進行敲除，去脂肪酸飽和酶表達量大幅減少，大豆飽和油含量增高，延長了大豆的保存時間。

1.3 歸巢核酸酶技術

歸巢核酸酶是一種稀有的大范圍核酸內切酶，能夠識別其他內切酶所不及的長DNA 序列，特異性識別的切割位點也較大（通常大于14 bp），因此脫靶效率極低。但是天然存在的歸巢核酸酶的位點極少，可利用率和突變率不高。且該酶只有一個結構域，DNA 結構發生的微小改變就可能導致切割失敗。歸巢核酸酶的設計難度很大，對技術要求嚴苛，不宜進行人工改造，因而該技術難以在基因編輯領域廣泛使用[16]。由于歸巢核酸酶的高特異性，在人類基因組中發生解理的頻率低，可以作為具有高針對性的分子剪刀靶向于特定的基因達到基因治療的目的。Redondo 等[17]設計改造的歸巢核酸內切酶有可能修復在“著色性干皮膚”中發生突變的基因。

1.4 規律成簇間隔短回文重復序列（CRISPR）技術

CRISPR即規律成簇間隔短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）。1987 年Ishino 等[18]首次在大腸埃希菌中發現該重復序列；2005 年，CPISPR 技術的研究有了重大進展，科學家們發現被侵染細菌的CRISPR 中，其間隔序列和入侵它們的病毒噬菌體部分核酸鏈有著高度同源性，進而推測CPISPR 與細菌免疫存在必然聯系[19]。2007 年，Barrangou 等[20]發現嗜熱鏈球菌以CRISPR/Cas系統成功抵抗噬菌體的入侵。噬菌體首次侵入細菌時，其序列片段會被Cas 蛋白編碼的酶切割下來并整合到CRISPR 的重復序列間，賦予細菌獲得性免疫的功能，如果同一噬菌體再次入侵便能被細菌識別并直接切割，至此基于CPISPR的免疫機制更加明確。CRISPR/Cas系統是原核生物所特有的用來抵抗病毒感染的免疫系統。該系統的基因座包括3個部分，5'端的tracrRNA 基因、中間的Cas 蛋白編碼區以及3'端的CRISPR 基因座。II 型系統存在于大多數細菌中，是在Cas9 蛋白存在的前提下引起細胞免疫降解噬菌體或外源DNA，結構較簡單，便于改造利用，只需要人工合成一條gRNA即可實現對基因的特異性修飾，因此備受青睞。劉婷婷等[21]對毛白楊中的內源基因八氫番茄紅素脫氫酶進行敲除，獲得多個突變體株系；胡春華等[22]針對香蕉的MaPDS 基因成功構建了MaPDS 編輯載體，以農桿菌轉化法成功轉入植物體并經一系列篩選培養最終獲得具抗性的獨立轉化株系；禹明森等[23]根據生菜FANCM 基因建立了生菜的CRISPR/Cas9 基因編輯體系，為培育更具優勢性狀的新品種奠定了基礎；周巖等[24]基于CRISPR 以基因槍轉化法對非香型粳稻品種“吉粳88”進行基因編輯并成功獲得純合的子一代；奉寶兵等[25]利用CRISPR/Cas9 技術對脫支酶基因進行定點編輯獲得了等位變異的遺傳材料；王金彪等[26]通過農桿菌轉化法對甘藍型油菜的BnaLCR78基因實現了定點敲除，為后續的基因功能研究奠定了基礎。

基因編輯效率受載體類型、材料狀態和轉化體系等多種綜合因素的影響，編輯效率偏低和容易脫靶等仍是編輯過程中的難題。在原有基礎上對基因編輯的體系進行優化是主要任務之一。統計發現sgRNA 3'端第20 位堿基為G 或第16 位堿基為C 時編輯效率相對較高[27]，但這些結論往往是經過大量試驗和數據歸納得到，具體作用機制并不明確，因此要得到特異性高的sgRNA不僅需要理論知識的鋪墊，還要進行大量重復試驗才能優中選優。一種氨基酸可由多個密碼子編碼，但環境、遺傳和進化等多因素影響讓不同物種有各自的密碼子偏好性，sgRNA與物種的密碼子偏好性一致可能會提高基因編輯的效率，如果根據物種的偏好性對Cas9 的蛋白進行改造優化，Cas9 在生物體內的表達活性可能較高。例如，禾本科植物基因組中G 和C含量較高，可以據此提高Cas9 蛋白密碼子的C 和G含量去適應該物種的密碼子偏好性；以人類基因密碼子優化的Cas9 在水稻中表達量和突變率都很低，而基于水稻密碼子優化的Cas9 蛋白靶向同一序列，突變效率顯著提高；同一啟動子在不同物種或不同啟動子在同一物種內的表達效率皆有所差異，在選擇啟動子時可以借鑒其他物種編輯成功的案例。基因編輯體系初步建立時，可以同期構建不同啟動子驅動的載體，根據試驗結果選擇最適合該物種的啟動子；也可以通過啟動子的串聯，增加啟動子個數以增加驅動能力，提高表達效率。未經改造的野生型Cas9 蛋白能切割雙鏈DNA形成DSB，人為地將Cas9 蛋白的某個結構域失活使其成為Cas9 nickase（nCas9），該蛋白就只具有單鏈切割活性產生SSB（single-strand breaks），此時細胞會以高保真的堿基切除方式進行修復，也可以降低脫靶效率[28]。如果將2 個結構域都失活形成Dead Cas9（dCas9），Cas9 將不具有核酸酶活性，但仍可以在gRNA 引導下與靶序列結合發揮轉錄因子的作用，促進或抑制基因的表達；Cpf1 是單鏈crRNA 介導的一種核酸內切酶，Cas9 更具優勢：Cpf1 分子量小，更容易被導入細胞，Cas9在兩條鏈的相同位置進行切割產生平末端，有利于細胞啟動NHEJ 修復途徑。而Cpf1 在雙鏈的不同位置進行切割產生黏性末端，有利于細胞啟動HR 修復途徑，更適用于基因敲入。Cas9 的切割位點臨近PAM序列，但Cpf1 切割位點距離識別的序列較遠，擴大了靶基因的范圍，編輯位點多樣性增加。Cpf1脫靶效率低，且具有雙重活性，能切割DNA 和RNA[29]。

2 基因編輯技術在人參中的應用

2.1 推進人參基因組學研究

研究物種的基因組是分子生物學的重要任務之一，對基因組結構、定位和功能的分析能揭示物種生長發育的規律，從根本上探尋不同個體間的差異和共性。研究基因功能的方法有很多種，如基因敲除、基因克隆、反義RNA 和RNAi 等。陳超等[30]從人參葉片中克隆了PgAGO1 基因并進行生信分析，提取人參不同部位的RNA，通過qRT-PCR 技術檢測所克隆的基因在人參不同部位的表達情況，發現該基因在人參花中的表達量高，在根中的表達量較低，為PgAGO1 基因在人參基因組中的功能研究奠定了基礎。梁彥龍等[31]基于反義RNA 技術構建了人參環阿屯醇合酶（CAS）基因的反義表達載體，抑制了甾醇的合成途徑，使前體物質氧化角鯊烯更多地流向皂苷合成，獲得了皂苷含量相對較高而甾醇含量較低的發根系，明確了CAS基因在人參代謝中的途徑以及該基因在人參皂苷合成中的調控作用。曹豪杰等[32]利用RNAi 技術干擾-香樹素合酶（ -AS）基因的表達，以期抑制齊墩果烷型皂苷（Ro）的代謝通路，使更多的前體物質流向合成達瑪烷型皂苷的途徑，試驗成功降低了Ro 在人參發根中的含量，驗證了 -AS 基因在人參皂苷合成中的功能并為研究人參皂苷的合成機制提供了依據。基因編輯技術的問世給基因功能的探究提供了新的思路和方法，基因編輯技術不但能從DNA 水平上對基因進行調控，還實現了基因的定點敲入、敲除乃至單堿基替換等，從根本上改變基因的表達，進而通過蛋白質種類、結構的改變和性狀的差異分析基因功能，以反向遺傳學的思路對基因組進行研究，再輔以基因測序和互補試驗等手段對該基因的功能進行多方面驗證。王浩等[33]構建了CRISPR/Cas9 基因編輯敲除載體靶向矮牽牛的miR l59a 和miRl59b 基因，miRl59b 缺失的突變體材料與野生型矮牽牛相比，葉片數在現蕾期增多，葉面積增大，開花延遲，植株變高，研究補充了miR159 基因家族對于植物觀賞性狀的作用。如果建立起人參基因編輯的體系，就能對人參的基因組進行更全面深入的補充，而人參基因組的深入研究能為基因編輯目的基因提供多方位的選擇。

2.2 調控皂苷合成

對藥用植物來說，提高其有效成分的含量具有深遠意義。隨著分子生物學的發展，越來越多的研究開始從基因層面對生物合成和代謝通路進行調控。贠小蕓等[34]基于釀酒酵母三萜類化合物合成路徑，利用CRISPR-Cas9 技術增加-香樹脂醇上游主路關鍵酶基因的表達量并減少支路中關鍵基因的拷貝數調控前體物質的流向，獲得了-amyrin 產量較高的酵母工程菌。人參化學成分多樣，人參皂苷是人參主要的活性成分之一，是由苷元和糖相連而成的糖苷類化合物，具有抑癌抗癌、免疫調節[35]和抗氧化等功效。但皂苷在人參中的含量較低且不宜分離。通過種植量的擴大或提取工藝的優化只能在一定程度上緩解這一現狀，并不能從根源上解決問題。目前，越來越多的研究人員對皂苷的合成和代謝途徑進行了深入研究，挖掘皂苷合成途徑中的關鍵基因，并利用現代生物技術手段從基因層面進行調控進而影響人參皂苷的合成，達到提高人參皂苷產量的目的。若以人參皂苷合成途徑中的主調控基因作為靶向基因，增加主路基因的表達量或抑制、阻斷支路基因的表達，有望從基因層面實現對皂苷合成的調控。如敲除人參環阿屯醇合酶（CAS）基因，使人參皂苷的前體物質氧化角鯊烯更多地流向合成皂苷的路徑。以基因編輯的方式對人參代謝過程中的基因進行調控，有望實現人參特異化和產量化。

2.3 推進人參分子育種

傳統的育種工作經常圍繞系統育種、雜交育種和誘變育種展開。這些育種方式往往存在過程繁瑣和工作量大且育種結果不確定等問題，基于分子生物學的新型育種方式令這一現狀有所改觀。轉基因育種技術曾備受關注，但該技術常因插入位點的不確定導致育種失敗甚至產生對人不利的結果。基因編輯技術不但可以實現基因組定點改造和定向育種，在較短育種周期內培育出產量高品質優良的品種，而且該技術只是對基因起到編輯的作用，與自然變異無本質差別，后期可以篩選出只有目標基因突變的材料且Cas9 和載體等不會遺傳到子代，大大減少了外源基因的污染，基因編輯已經迅速引領了新一代育種工作的潮流。Khanday等[36]采用CRISPR/Cas9 敲除了BBM 基因，終止了卵細胞的減數分裂行為并使水稻胚胎終止發育，為物種的無性繁殖開辟了道路。矮稈品種的選育是主要的育種目標之一，水稻SD1 等位基因功能的缺失會獲得半矮稈的表型。胡雪嬌等[37]敲除了水稻SD1 基因并獲得了純合突變體，其株高較野生型下降了25% 左右，為水稻的育種工作提供了極大便利。人參的栽培歷史短，品種資源匱乏，育種周期長。人參一般五年生留種，且結實數量少，即便獲得性狀優良的遺傳變異類型，也會因各種條件限制難以推廣。目前人參的分子育種工作還沒有得到深入展開，如果將基因編輯技術應用到人參輔助育種工作中，有望縮短其育種年限，培育出性狀優良、高產高抗的新型人參品種。

2.4 提高人參抗性

人參生長年限長，道地性強，對生長環境要求嚴格。目前人參的抗逆抗病機制并不完善且缺乏相應的品系，大大制約了人參產量和品質的發展。如病蟲害等仍是影響人參生長發育、減少其經濟價值的不利因素，施加大量的化學制劑雖能短時間改善這種現狀，但隨著病原生物耐藥性的增加會適得其反，其藥物殘留不僅打破了種植地生態系統的平衡，也危害了人類健康。結合分子生物學手段選育抗性品種能從根本上增加植物抵抗不利環境的能力，也一定程度上緩解了病蟲害的困擾。基因編輯技術問世以來在植物育種工作上得到了廣泛應用并取得了一定成效，也克服了傳統轉基因技術存在的位點不確定和轉化效率低等問題。雷建峰等[38]構建了CRISPR/Cas9 載體敲除野生擬南芥的抗旱負調控基因GGB，突變體較野生型失水率降低，抗旱性增加但材料的正常生長發育未受影響，為植物的抗逆研究提供了思路，同時為不同植物GGB 同源基因的研究奠定了基礎。徐鵬等[39]針對稻瘟病的抗感差異基因Pita、隱形狀態下的抗稻瘟病菌基因Pi21 和稻瘟病抗性負調控基因ERF922，利用CRISPR/Cas9系統對其進行定點編輯并獲得了不同突變類型的材料，對純合突變的幼苗進行稻瘟接種鑒定，發現其防衛基因的表達量增加，對稻瘟病的抗性增加。初旸等[40]參照人參全基因組利用生信分析預測了人參7個家族的1 652 個抗病基因并分析其進化關系和結構特點，為人參抗性分子育種提供了借鑒。物種之間雖然存在差異，但也存在大量的同源基因，基因組較為完善的模式植物和常見植物種能為人參抗性基因的研究提供參考。利用基因編輯技術的定向性將抗性基因整合到人參的基因組中，或者敲除對人參抗性的負調控基因，能從根本上提高人參的抗性，開辟人參品質改良的新途徑。

3 結語與展望

基因編輯技術自問世以來創造了一個又一個令人矚目的研究成果，得到了無數科研工作者的青睞。盡管目前以CRISPR/Cas9 技術為主的基因編輯系統仍存在一些技術上的難題，但隨著研究的深入和經驗的積累這些難題終將被攻克。如果實現該技術在人參相關領域的應用，對人參的遺傳育種、品質改良以及基因功能研究將具有深遠意義。雖然人參基因組序列保守性很高，突變和重組率都很低，但與常見的農作物和模式植物相比，人參的基因組學和分子生物學研究基礎十分薄弱且范圍較窄，既沒有完善的基因組數據，又缺乏有效的遺傳轉化體系。盡管對人參進行基因編輯并建立完善體系的難度較大，但基因編輯技術已經得到廣泛應用，技術手段也在不斷更新和進步，這為人參基因編輯體系的建立提供了充足的理論知識和可借鑒的經驗，因而實現基因編輯技術在人參這種藥用植物上的應用，并逐步建立成熟的基因編輯體系指日可待，人們也可以從基因層面重新定位和審視人參這種藥用植物。