全自動微柱凝膠法用于直接抗人球蛋白試驗初篩的臨床觀察

顧晨晨，曹敏鳳，戎瑞明，吳擘颋

復旦大學附屬中山醫院輸血科，上海 200032

直接抗人球蛋白試驗(direct antiglobulin test,DAT)主要用于檢測紅細胞上結合的不完全抗體，在自身免疫性溶血性貧血、免疫性溶血性輸血反應、新生兒溶血病等疾病中具有重要診斷價值，但傳統的試管法DAT完全依賴手工操作，且需要檢測人員具有一定的判讀結果經驗，并不適合用于大批量臨床標本檢測[1-2]。近年來日益成熟的微柱凝膠法與傳統試管法相比具有標準化、操作簡便、結果清晰、敏感性高等優點，且可實現全自動化檢測[3-5]。復旦大學附屬中山醫院輸血科自2016年開始采用全自動微柱凝膠法用于臨床標本的DAT初篩，顯著提高了報告速度和一致性，但也發現部分全自動微柱凝膠法初篩陽性標本可能受臨床因素干擾而致假陽性。為進一步評估全自動微柱凝膠法用于臨床標本DAT初篩的價值和報告注意事項，本研究對我院1 205例DAT結果進行了總結，并分析了與全自動微柱凝膠法假陽性有關的臨床因素，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2016年12月至2017年11月在復旦大學附屬中山醫院輸血科進行DAT檢測的住院患者資料1 205例。

1.2 DAT檢測 使用枸櫞酸鈉抗凝真空采血管送檢的患者外周全血標本，采用全自動微柱凝膠法(IH-1000全自動血型分析儀，Biorad，美國)進行DAT初篩。微柱凝膠法低離子抗人球蛋白卡(ID-Card LISS/Coombs)由美國Biorad公司提供。陽性者采用試管法進行復檢和分型。試管法直接抗人球蛋白試驗操作參見《輸血技術學》[6]。用于試管法的單克隆抗人球蛋白試劑(多特異性、抗-IgG、抗-C3d)由上海血液生物醫藥有限責任公司提供。

2 結 果

2.1 住院患者DAT檢測陽性率及反應強度 2016年12月至2017年11月共進行DAT檢測1 205例，全自動微柱凝膠法初篩陽性180例(14.9%)，其中6例(3.3%)、23例(12.8%)、41例(22.8%)、+ 95例(52.8%)、+/- 15例(8.3%)。陽性標本采用試管法復檢陰性18例(10.0%)，其中13例初篩結果為+，其余5例為+/-，詳見圖1。

圖1 全自動微柱凝膠法DAT初篩陽性標本反應強度分布及相應假陰性比例

2.2 全自動微柱凝膠法DAT初篩假陽性患者臨床特征 結果(表1)顯示，全自動微柱凝膠法DAT初篩假陽性患者主要來自于血液科(12例)，其余包括風濕免疫科(2例)、感染病科(2例)、消化科(1例)及急診科(1例)，其中淋巴造血系統腫瘤患者12例、自身免疫性疾病患者5例、病毒感染患者1例。患者中位年齡63.0(21～90)歲，男性女性各9例，血紅蛋白中位值86.5(43～117)g/L，網織紅細胞比值1.85(0.6～4.0)%，均未見明顯溶血征象。

實驗室檢查發現白細胞升高4例(例8、例9、例11、例16)；血清總球蛋白升高7例(例2、例3、例9、例12、例13、例14、例16)，其中1例(例12)血清

表1 全自動微柱凝膠法直接抗人球蛋白試驗假陽性患者臨床特征

所有患者試管法抗人球蛋白試驗及分型陰性、抗體篩選陰性，近期輸血史和生物制劑應用史均為檢測前30天內。ND：未查。單采血小板1袋：血液成分單采機采集來自一個獻血者的血小板，含有的血小板數量至少在2.5×1011以上

IgG未見升高但有近期輸注靜脈丙種球蛋白史，其余6例均為血清IgG升高(1例干燥綜合征患者血清免疫固定電泳提示IgG-κ單克隆球蛋白)；另有2例(例7、例8)血清總球蛋白未見升高但檢出IgG-κ單克隆球蛋白，1例(例1)血清總球蛋白未見升高但血清IgM升高。

在DAT檢測前30 d內，5例患者接受過輸血治療，其中3例(例9、例10、例17)輸注懸浮紅細胞、4例(例5、例9、例10、例12)輸注單采血小板；3例患者接受過生物制劑治療，其中2例(例6、例8)使用了利妥昔單抗、1例(例12)使用了靜脈丙種球蛋白。

3 討 論

作為建立于20世紀40年代的經典免疫血液學實驗方法，目前DAT仍然是臨床診斷紅細胞免疫相關疾病時最重要的實驗室檢查，其技術核心是對紅細胞膜上所結合免疫球蛋白的檢出，傳統試管法DAT陽性至少需要每個紅細胞上結合150～500個IgG分子[1,7]。近年來隨著免疫血液學技術的發展，出現了基于微柱凝膠技術、固相技術、流式細胞技術等改良DAT檢測方法，作為傳統試管法DAT的補充，一方面可以提高DAT檢測的敏感性，另一方面有利于將DAT檢測自動化[8]。本研究采用全自動微柱凝膠法用于臨床標本的DAT初篩，在1 205例住院患者中總體陽性率為14.9%，其中弱陽性(+及+/-)占61.1%，而所有后續試管法復檢陰性者(18例)均來自于弱陽性患者，分別占初篩+及+/-總數的13.7%(13/95)和33.3%(5/15)，其臨床資料均未提示溶血征象，考慮全自動微柱凝膠法DAT初篩假陽性可能大，此結果也符合既往文獻報道DAT反應強度是診斷自身免疫性溶血性貧血的最重要指標之一[8-9]，DAT弱陽性(反應強度以下)時非特異性病因相對較多。

臨床標本DAT陽性的機制主要包括紅細胞膜上免疫球蛋白/補體致敏、免疫球蛋白非特異性吸附以及致敏紅細胞清除速率降低等[10-13]。臨床上導致DAT假陽性最常見的原因是免疫球蛋白非特異性吸附，多見于淋巴造血系統腫瘤產生單克隆或寡克隆增高的球蛋白，以及自身免疫性疾病或感染性疾病過程中產生多克隆增高的球蛋白[10-11]，本研究在18例DAT假陽性患者中發現10例存在不同程度的球蛋白升高或異常球蛋白，提示免疫球蛋白非特異性吸附在全自動微柱凝膠法DAT檢測中仍是假陽性的主要原因。此外由于全自動檢測時簡化了紅細胞洗滌過程，臨床標本中過高的白細胞數也可能干擾受檢紅細胞在凝膠毛細管中的離心沉降過程，從而導致DAT假陽性。血液循環中被免疫球蛋白致敏但未持續活化補體的紅細胞通常經由單核-巨噬細胞系統清除，某些病理狀況可造成單核-巨噬細胞系統功能異常，如高免疫球蛋白血癥時巨噬細胞表面Fc受體飽和、系統性紅斑狼瘡中巨噬細胞吞噬功能下降等，進而導致生理狀況下應被清除的紅細胞仍存留于循環中，在使用更為敏感的微柱凝膠法時易引起DAT弱陽性[12-13]。

全自動微柱凝膠法DAT檢測受標本前處理因素影響小、檢驗過程標準化、結果清晰可保存，很大程度上避免了傳統試管法DAT檢測過程中手工操作和結果判讀過程中可能產生的誤差，能夠滿足各級別醫療機構臨床標本初篩的要求，但臨床部門需注意避免在多次輸血或應用特殊生物制劑后短期內送檢，以減少DAT檢測結果解釋困難、需要重復送檢的情況。本研究進一步指出，全自動微柱凝膠法DAT可能存在的假陽性集中于弱陽性標本中，大部分可以發現免疫球蛋白異常、白細胞升高等明確干擾檢測的因素。但也有小部分假陽性結果可能反映了疾病相關的單核-巨噬細胞系統功能異常，被免疫球蛋白致敏但未被及時清除的紅細胞容易被敏感的方法檢測得到，值得擴大標本量進一步研究。