高尿酸對大鼠腎小球足細胞的損害作用

王 昱，王 嬌，繆 妙，鮑曉榮

復旦大學附屬金山醫院腎內科，上海 201508

高尿酸血癥與慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)之間關系密切，互相影響。一方面隨著CKD進展，腎功能不斷丟失，尿酸從腎臟排泌出現障礙，導致體內尿酸水平進一步增高；另一方面，高尿酸血癥能造成腎臟損害，并且是CKD進展的重要因素[1]。一般認為，尿酸造成的腎臟損傷主要位于小管及間質部位，其主要機制為尿酸鹽結晶沉積在腎組織導致局部發生炎癥反應，出現腎小管萎縮及間質纖維化[2]。然而，近年來也有研究[3-4]發現，尿酸亦可損傷腎小球系膜細胞。這就提示尿酸導致的腎損害并非局限于腎小管-間質部位。足細胞作為腎小球的固有細胞，在腎臟病進展中發揮重要作用。尿酸對足細胞是否有損害作用及其機制如何目前尚不清楚，本研究擬就此進行探討。

1 材料與方法

1.1 動物及模型的建立 雄性SD大鼠40只，體質量163～212 g，6～7周齡，隨機分為4組，每組10只，即對照組、輕微高尿酸組、高尿酸組、別嘌醇干預組。所有大鼠正常喂養。其中，輕微高尿酸組、高尿酸組、別嘌醇干預組均以尿酸酶抑制劑—氧嗪酸鉀灌胃，劑量分別為每日400、800、400 mg/kg；別嘌醇干預組再以別嘌醇灌胃，劑量為25 mg/kg。喂養期間每周稱大鼠體質量，以調整給藥劑量。對照組每日予以等容量蒸餾水灌胃。

1.2 檢測方法 所有大鼠飼養24周后處死。心臟內取血，離心后取血清待檢。分離出左腎并切除，0.9%氯化鈉液沖洗后，分別行蘇木精-伊紅(H-E)染色、免疫組化檢測、Western印跡、RT-PCR、電鏡檢查。血清指標尿酸(UA)、肌酐(Scr)用生化分析儀檢測。H-E染色試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司，染色后在光鏡下觀察腎小球及腎小管、腎間質病變。

1.2.1 免疫組化法檢測AngⅡ、IL-6、SOD在腎組織中的表達 多聚賴氨酸溶液、免疫組化筆、PBS、Triton-X100、AngⅡ抗體、IL-6抗體、SOD抗體、檸檬酸鈉緩沖液、50×TAE電泳緩沖液購自江蘇凱基生物技術股份有限公司。DAB Kit、EliVision plus試劑盒購自福州邁新生物技術開發公司。蘇木精染色液購自南京建成生物工程研究所。中性樹膠購自國藥集團化學試劑有限公司。

腎組織經二甲苯沖洗2次，每次5 min，先后予以100%乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇各沖洗3 min，PBS沖洗3次(每次3 min)。將抗原修復緩沖液加熱至沸騰，將組織切片放到已沸騰的緩沖液中20 min，自然冷卻后，PBS沖洗3次(每次5 min)；3%H2O2，15～25 ℃孵育10 min，PBS沖洗3次(每次5 min)。滴加即用型山羊血清50～100 μL,室溫孵育20 min。滴加一抗(1∶200稀釋)50～100 μL，37℃濕盒孵育2 h，PBS浸洗3次，滴加增強劑50 μL，室溫濕盒孵育30 min。PBS浸洗3次；滴加通用型IgG抗體-Fab段-HRP多聚體50 μL，37℃孵育30 min。PBS浸洗3次；用新鮮配制的DAB顯色液室溫下顯色5～10 min，蒸餾水沖洗10 min終止顯色。蘇木精復染，蒸餾水沖洗5 min。0.1% HCl分化，自來水沖洗，藍化。切片經梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，晾干后觀察。各指標的表達情況用平均光密度值表示。平均光密度值=積分光密度(IOD)/陽性面積分布(AREA)。

1.2.2 Western印跡法檢測nephrin、podocin在腎組織中的表達 取100 mg固體組織置于培養皿中，手術剪剪碎成約3 mm×3 mm的小塊，用預冷Lysis Buffer細胞裂解液提取蛋白。根據凱基Braford蛋白含量檢測試劑盒說明測定所提取蛋白的濃度，取等量組織蛋白樣本于沸水中煮5 min，使蛋白變性后進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉入NC膜，轉膜完畢后，用含5%脫脂奶粉的封閉液搖床震蕩2 h；用特異抗nephrin、podocin抗體孵育(用5%的封閉液1∶500 稀釋，抗體購自武漢博士德生物工程有限公司)，以β-actin作內參 (1∶1 500，南京凱基公司)，洗膜后，二抗孵育(1∶2 000，南京凱基公司)，室溫搖床振蕩反應1～2 h；ECL(南京凱基公司)化學發光法曝光，使用G:BOX chemiXR5成像。運用Gelpro軟件進行灰度值分析。

1.2.3 RT-PCR法檢測nephrin mRNA、podocin mRNA在腎組織中的表達 細胞樣本用冷PBS洗3次，六孔板中每孔加入1 mL TRIzol(美國Invitrogen公司)，對總RNA進行純度的測定，定量后反轉錄成cDNA(42℃ 1 h，70℃ 10 min,然后置于冰上5 min)，cDNA置于-20℃保存。使用時稀釋10倍，按照反轉錄試劑盒(日本 TOYOBO)說明書進行PCR擴增，反應條件：95℃變性5 min；變性95℃ 15 s、退火60℃ 20 s、延伸72℃ 40 s，擴增定量程序40個循環。熔解曲線：60～95℃，加熱速率為0.1℃/s，內參基因為GAPDH。每個樣品均設3個復孔，重復實驗2次。引物序列：nephrin上游引物5′-GCT GGC CCA TCA CTG TCA TT-3′，下游引物5′-TCA GTG ACT TTG TTC TTG TGC T-3′；podocin上游引物 5′-AAG AAG TCA AAG GCC GGG AG-3′，下游引物5′- TCC ACA TTC ACT ACC GTG GC-3′；GAPDH上游引物 5′-GGC CTT CCG TGT TCC TAC C-3′，下游引物5′-CGC CTG CTT CAC CAC CTT C-3′。

1.2.4 電鏡下觀察足細胞的超微形態 腎組織標本用PBS洗滌后置于EP管，用2.5%戊二醛(磷酸緩沖液配制)固定2 h；4℃冰箱內先后予以50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇、90%乙醇+90%丙酮(1∶1)、90%丙酮脫水15～20 min，再于室溫下用100%丙酮脫水3次(每次15～20 min)；室溫下純丙酮+包埋液(2∶1 )放置3 h，丙酮+包埋液(1∶2)過夜，純包埋液于室溫下放置3 h，37℃烘箱內過夜，45℃烘箱及60℃烘箱內分別放置12、24 h。用超薄切片機切成50～60 nm薄片，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色。切片在透射電鏡下觀察、拍片。

2 結 果

2.1 各組血肌酐及尿酸水平的比較 結果(表1)表明：兩兩相比，血肌酐水平差異均無統計學意義，血尿酸水平差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 H-E染色后觀察各組腎小球病理表現 結果(圖1)表明：各組大鼠腎小球均未見明顯病理學異常；輕微高尿酸組、高尿酸組腎小球系膜區有核細胞數略多。

表1 各組間大鼠血肌酐及尿酸水平的比較 n=10，cB/(μmol·L-1)

*P<0.01與對照組相比；△P<0.01與輕微高尿酸組相比；▽P<0.01與高尿酸組相比

圖1 大鼠腎臟H-E染色結果A:對照組；B:輕微高尿酸組；C:高尿酸組；D:別嘌醇干預組.Original magnification:×200

2.3 免疫組化檢測AngⅡ、IL-6、SOD在腎組織中的表達 結果(圖2、圖3)表明：AngⅡ主要表達于腎小球系膜區，少量表達于腎小管上皮細胞；對照組、輕微高尿酸組、高尿酸組、別嘌醇干預組AngⅡ表達水平分別為0.19±0.04、0.28±0.06、0.37±0.09、0.24±0.05。IL-6主要表達于腎小管上皮細胞，少量表達于腎小球；對照組、輕微高尿酸組、高尿酸組、別嘌醇干預組IL-6的表達水平分別為0.22±0.02、0.25±0.02、0.29±0.04、0.23±0.01。SOD在腎小球及腎小管內均表達；對照組、輕微高尿酸組、高尿酸組、別嘌醇干預組SOD的表達水平分別為0.30±0.05、0.22±0.05、0.18±0.03、0.26±0.02。各組兩兩比較AngⅡ、IL-6、SOD差異均有統計學意義(P<0.05)。

圖2 免疫組化檢測各組腎組織AngⅡ、IL-6、SOD的表達A：AngⅡ；B：IL-6；C：SOD.Original magnification:×200

圖3 各組大鼠腎組織AngⅡ、IL-6、SOD表達的比較

*P<0.05,**P<0.01與對照組相比；△P<0.05與輕微高尿酸組相比；▽▽P<0.01與高尿酸組相比

2.4 Western印跡檢測nephrin、podocin在腎組織中的表達 結果(圖4)表明：對照組、輕微高尿酸組、高尿酸組、別嘌醇干預組大鼠腎組織nephrin相對表達水平分別為0.49±0.03、0.44±0.02、0.38±0.04、0.46±0.02，podocin相對表達水平分別為0.36±0.03、0.31±0.01、0.28±0.03、0.33±0.02，各組間兩兩相比差異均有統計學意義(P<0.05)。

2.5 RT-PCR法檢測nephrin mRNA、podocin mRNA在腎組織中的表達 結果(圖5)表明：對照組、輕微高尿酸組、高尿酸組、別嘌醇干預組大鼠腎組織nephrin mRNA表達水平分別為1.02±0.05、0.60±0.04、0.48±0.03、0.71±0.05，podocin mRNA表達水平分別為0.99±0.03、0.62±0.03、0.47±0.03、0.74±0.03，各組間兩兩相比差異均有統計學意義(P<0.05)。

圖4 Western印跡檢測各組腎組織nephrin、podocin的表達

1：對照組；2：輕微高尿酸組；3：高尿酸組:4：別嘌醇干預組.*P<0.05,**P<0.01與對照組相比；△P<0.05與輕微高尿酸組相比；▽▽P<0.01與高尿酸組相比

圖5 RT-PCR法檢測腎組織nephrin、podocin的表達

*P<0.05,**P<0.01與對照組相比；△P<0.05與輕微高尿酸組相比；▽▽P<0.01與高尿酸組相比

2.6 電鏡觀察各組腎臟病理形態 結果(圖6)顯示：對照組腎小球基本正常，系膜區少量電子致密物沉積，足細胞未見明顯病變，腎小管上皮細胞未見異常；輕微高尿酸組腎小球基本正常，足細胞形態基本正常，有足突融合現象，腎小管上皮細胞輕度萎縮；高尿酸組腎小球系膜區增生、基質略增多，足細胞胞體基本正常，足突融合較明顯，高爾基體略腫脹，腎小球上皮細胞腫脹、萎縮較明顯；別嘌醇干預組腎小球系膜略增生，足細胞胞體基本正常，部分足突有融合現象，腎小管上皮細胞略腫脹。

圖6 各組大鼠腎臟病理(電鏡)

A:對照組；B:輕微高尿酸組；C:高尿酸組；D:別嘌醇干預組.Original magnification:×1 000

2.7 相關性分析 結果(圖7)顯示：血尿酸水平與腎組織中nephrin、podocin、SOD的表達負相關，而與腎組織中AngⅡ及IL-6的表達正相關。腎組織中AngⅡ、IL-6的表達與nephrin、podocin的表達負相關；腎組織中SOD的表達與nephrin、podocin的表達正相關(P<0.05)。

3 討 論

大量研究已證實高尿酸血癥對腎臟存在損害作用。美國Jackson心臟研究[5]數據顯示，血尿酸增高與腎功能迅速下降及CKD發生相關。國內一項隊列研究[6]顯示，血尿酸水平與估算腎小球濾過率(eGFR)下降和CKD發生的可能性增加獨立相關。目前認為尿酸導致腎臟損害機制較為復雜，尿酸鹽沉積可能直接導致腎臟損害，也可能通過小管-間質病變[7]、血管病變等引起腎臟損害。也有研究[8]表明，尿酸升高是腎小球損傷的獨立危險因素，而不是腎小管損傷的獨立危險因素。因此有必要進一步研究尿酸與腎小球病變之間的關系。

足細胞是腎小球內主要的固有細胞之一，由細胞體、主突和足突組成。足細胞發生損害時，其特異性蛋白如nephrin、podocin等出現表達異常[9]，提示通過檢測其表達情況可反映足細胞損傷程度。近年研究[10]表明，足細胞損傷與腎小球疾病的進展關系密切，是糖尿病腎病、IgA腎病、狼瘡性腎炎、局灶節段硬化性腎病綜合征等多種腎臟病進展的重要機制之一。導致足細胞損傷的因素眾多、機制復雜，包括中毒、感染、血流動力學改變、代謝性因素(如高糖刺激、蛋白負荷過重)等。然而，高尿酸血癥是否與足細胞損傷有關，目前鮮有研究。

本研究通過氧嗪酸鉀灌胃的方法成功建立高尿酸血癥大鼠模型。電鏡觀察各組大鼠腎小球足細胞病變，可見高尿酸血癥大鼠存在不同程度的足突融合，且隨著尿酸水平升高，足突融合更趨嚴重。高尿酸血癥大鼠腎小球足細胞內線粒體、高爾基體等細胞器也存在程度輕重不一的損害。本研究通過Western印跡及RT-PCR法發現，輕微高尿酸組、高尿酸組nephrin、podocin的表達均顯著低于對照組，其中高尿酸組表達更低，別嘌醇干預血尿酸水平，nephrin、podocin的表達回升。相關性分析顯示，血尿酸水平與腎組織中nephrin、podocin的表達負相關。上述結果顯示，高尿酸血癥可造成足細胞損害，且血尿酸水平與足細胞損害嚴重程度有關。

圖7 血尿酸水平與腎組織中各指標的相關性分析

進一步研究顯示，輕微高尿酸組、高尿酸組腎組織AngⅡ、IL-6的表達較對照組增加，其中高尿酸組增加更明顯，別嘌醇干預組腎組織AngⅡ、IL-6的表達水平回落；SOD的表達水平呈相反變化，各組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)。相關性分析顯示，血尿酸水平與腎組織AngⅡ、IL-6、SOD的表達水平相關，而腎組織中AngⅡ、IL-6、SOD的表達水平與腎組織nephrin、podocin的表達亦相關。上述結果提示，尿酸可通過活化RAS系統，促進微炎癥狀態及氧化應激，從而導致足細胞損害，且損害嚴重程度與尿酸水平、RAS系統活性、微炎癥狀態、氧化應激水平正相關。

氧化應激反應是導致足細胞損傷的一個重要因素[11-13]。多項實驗[14-15]已證實，通過降低氧化應激反應可改善腎小球足細胞損傷。氧化應激水平增強可通過擾亂內質網穩態、激活足細胞內質網應激進而導致足細胞損傷，自噬也參與其中[16]。RAS系統活化也是導致足細胞損傷的重要機制之一[17]。RAS系統活化可通過增加鈣內流和活性氧的生成促進足細胞損傷，并可通過促進足細胞自噬、誘導足細胞肥大、增加細胞凋亡、改變腎小球基底膜表面電荷屏障等機制導致足細胞損傷[18-21]。腎臟局部微炎癥反應水平可改善腎臟病變[22]。在某些病理狀態下，足細胞表面炎癥因子表達異常，可加重足細胞損害及腎臟病理損傷[23]。

綜上所述，本研究采用氧嗪酸鉀灌胃的方法成功建立高尿酸血癥大鼠模型，研究表明高尿酸血癥可導致腎小球足細胞損害，且兩者間存在線性相關，用別嘌醇降低血尿酸水平后，足細胞損害減輕。其可能機制包括高尿酸血癥導致的氧化應激反應、RAS活化、微炎癥反應等。本研究進一步闡明了尿酸的腎毒性，并提示可通過調控體內氧化應激狀態、RAS活性、微炎癥反應等措施來減輕尿酸所導致的足細胞損害、延緩CKD進展。然而，導致足細胞損傷的原因、機制眾多，且不同原因、機制之間互相影響、互相作用，因此相關機制有待通過體外實驗等進一步證實。