ABCB1和CYP2C19基因多態(tài)性與動脈粥樣硬化性腦梗死患者氯吡格雷療效的相關性

李笑笑，呂佳寧，吳旭青，范 薇

復旦大學附屬中山醫(yī)院神經(jīng)內科，上海 200032

缺血性腦卒中嚴重威脅人類身心健康，并且其發(fā)病趨勢逐年遞增，盡早開始抗血小板治療(包括阿司匹林和氯吡格雷)不僅能顯著降低病死率和殘疾率，而且可減少缺血性腦卒中復發(fā)[1-3]。有研究[4]表明，在缺血性腦血管病二級預防中，氯吡格雷療效更佳，尤其適用于不能耐受阿司匹林及合并其他基礎疾病的患者。然而，有一部分患者即使長期規(guī)律服用氯吡格雷，仍會再次出現(xiàn)缺血性腦卒中及其他不良缺血性事件[5]，這種現(xiàn)象被稱為“氯吡格雷抵抗(clopidogrel resistance,CR)”。基因多態(tài)性是參與氯吡格雷抵抗的重要因素，2011年美國心臟病學會/美國心臟協(xié)會/美國心血管造影與介入學會指南提出使用氯吡格雷應當進行基因型的檢測[6]。

氯吡格雷是無活性的前體藥物，首先經(jīng)過胃腸道吸收(受到由多重耐藥基因ABCB1編碼的P-糖蛋白調控)[7]，經(jīng)腸道吸收的氯吡格雷85%被酯酶水解為無活性的羧酸衍生物排出體外，僅15%在肝臟內經(jīng)過細胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)酶系代謝為有活性的硫醇衍生物[8]。氯吡格雷在肝臟內需要經(jīng)過CYP450酶系統(tǒng)的兩步氧化代謝為活性代謝產(chǎn)物，其中CYP2C19在兩步氧化代謝中均發(fā)揮了重要作用[9]。CYP2C19失功能等位基因攜帶者中氯吡格雷活性代謝產(chǎn)物濃度顯著降低，且氯吡格雷的血小板抑制作用減弱[10]。因此，故ABCB1及CYP2C19基因突變是氯吡格雷抵抗的預測因子[11-12]。多項針對接受氯吡格雷治療的急性冠脈綜合征患者的研究顯示ABCB1基因突變及CYP2C19失功能等位基因突變使不良缺血事件發(fā)生風險增加[13-15]，而根據(jù)ABCB1及CYP2C19基因型制定個體化的精準抗血小板治療方案有助于減少不良缺血事件的發(fā)生[16-17]。

既往ABCB1及CYP2C19基因型在氯吡格雷的臨床應用研究大多集中在急性冠脈綜合征患者，而在缺血性卒中方面的研究還相對較少。也有少量研究顯示在服用氯吡格雷治療的缺血性腦卒中患者中，ABCB1基因突變與氯吡格雷抵抗發(fā)生并無相關性[18]，甚至可能減少不良血管事件的復發(fā)[19]；而CYP2C19失功能等位基因攜帶者發(fā)生早期神經(jīng)功能惡化、缺血性腦卒中及混合血管事件復發(fā)的風險更高[20-21]。但是，目前尚缺少在缺血性腦卒中尤其是針對動脈粥樣硬化性腦梗死患者中同時檢測ABCB1及CYP2C19基因型對氯吡格雷療效影響的研究。因此，本研究探討在急性動脈粥樣硬化性腦梗死患者中，不同ABCB1和CYP2C19基因型對氯吡格雷療效的影響，從而為患者的個體化用藥提供試驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 前瞻性收集2014年4月至2016年9月在復旦大學附屬中山醫(yī)院神經(jīng)內科住院治療的急性動脈粥樣硬化性腦血栓形成患者，收集患者的一般臨床資料，包括年齡、性別、既往史等。

納入標準：(1)年齡≥18歲；(2)經(jīng)頭顱CT或MRI證實的腦梗死，診斷符合第四次全國腦血管病學術會議修訂的腦梗死診斷標準[22]；(3)發(fā)病1周內，既往無服用氯吡格雷史；(4)符合新TOAST分型中的動脈粥樣硬化性血栓形成型[23]；(5)確診后即開始持續(xù)服用氯吡格雷75 mg/d，且≥7 d。

排除標準：(1)服用其他可能影響藥物(如華法林、貝前列素鈉、利伐沙班、奧扎格雷、西洛他唑、質子泵抑制劑等)；(2)具有明確的抗凝治療指征(已知的人工心臟瓣膜、房顫或其他需要抗凝的心臟疾病等)；(3)圍手術期出現(xiàn)的缺血性卒中；(4)合并腫瘤、顱內出血、顱內血管畸形、顱內膿腫以及非缺血性腦部疾病；(5)合并有嚴重的其他可能明顯影響治療和預后的嚴重急慢性疾病，如心梗、嚴重腎功能不全、癡呆、精神疾病等。

患者入組后開始服用氯吡格雷75 mg/d,并于服用氯吡格雷7 d后在患者知情同意的情況下，采集外周靜脈血1次，按實驗要求處理標本，分別行血栓彈力圖及ABCB1和CYP2C19基因型檢測。

1.2 基因型檢測 利用聚合酶鏈式反應技術分析患者ABCB1、CYP2C19基因型，采用基因檢測試劑盒(蘇州曠遠生物分子技術有限公司)通過熒光探針法直接檢測突變位點，通過是否表達標記的熒光來判斷基因型。本研究檢測的CYP2C19基因位點包括*1/*1(636GG,681GG)、*1/*2(636GG,681GA)、*1/*3(636GA,681GG)、*2/*2(636GG,681AA)、*2/*3(636GA,681GA)和*3/*3(636AA,681GG)。根據(jù)CYP2C19的基因位點分為3組：快代謝型(*1/*1)、中代謝型(*1/*2和*1/*3)、慢代謝型(*2/*2、*2/*3和*3/*3)。本研究檢測的ABCB1基因位點是C3435T，根據(jù)ABCB1基因位點分為野生型和突變型。

為了進一步分析ABCB1與CYP2C19兩種基因聯(lián)合突變對氯吡格雷療效的影響，根據(jù)突變基因數(shù)量，將入組患者分為A、B、C組，分組標準如下，A組：ABCB1、CYP2C19基因均無突變；B組：ABCB1或CYP2C19基因發(fā)生突變；C組：ABCB1和CYP2C19基因均發(fā)生突。

1.3 血栓彈力圖檢測 利用血栓彈力圖儀(TEG5000,Haemoscope,美國)采用不同的激活劑來檢測其血小板纖維蛋白凝塊強度，阿司匹林和氯吡格雷分別是通過花生四烯酸(AA)通道和二磷酸腺苷(ADP)通道來起作用的。血栓彈力圖首先使用高嶺土激活凝血酶，由于凝血酶的通道受阿司匹林和氯吡格雷的影響比較小，故可以通過這個通道近似地體現(xiàn)出患者所有的血小板纖維蛋白凝塊的功能(MA凝血酶)。AA/ADP激活劑，可以分別激活沒有被阿司匹林或氯吡格雷抑制的血小板和纖維蛋白，從而得出沒有被阿司匹林或氯吡格雷抑制的血小板和纖維蛋白的功能(MAADP(AA))。A激活劑僅激活纖維蛋白，得出纖維蛋白原的功能(MA纖維蛋白原)。通過這3個值，即可按以下公式計算出患者用藥后的抑制率。

1.4 神經(jīng)功能評估 所有患者均在入院時及服用氯吡格雷7 d后進行神經(jīng)系統(tǒng)功能評分，包括美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)及改良Rankin量表(mRS)，各量表評分的變化反映神經(jīng)功能缺損癥狀的改善或加重。

2 結 果

2.1 基線資料 共納入115例符合入選標準的患者，基線資料包括年齡、性別、體質指數(shù)(body mass index,BMI)、吸煙、飲酒、合并高血壓、糖尿病、高脂血癥、卒中史、NIHSS評分(入院時及服藥7 d后)、mRS評分(入院時及服藥7 d后)，結果詳見表1。

表1 研究對象的基線資料

2.2 各組均衡性比較

2.2.1 不同CYP2C19基因型患者基線數(shù)據(jù)的比較 按照CYP2C19基因型對入組患者進行分組，快、中、慢代謝型患者分別有46例、48例(其中*1/*2 40例，*1/*3 8例)、21例(其中*2/*2 18例，*2/*3 3例)。3組患者的基線資料包括平均年齡、性別、BMI、吸煙、飲酒、合并高血壓、糖尿病、高脂血癥、卒中史、NIHSS評分(入院時及服藥7 d后)、mRS評分(入院時及服藥7 d后)及他汀類藥物的使用所占比例差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具體數(shù)據(jù)詳見表2。

表2 不同CYP2C19基因型患者基線數(shù)據(jù)的比較

2.2.2 不同ABCB1基因型患者基線數(shù)據(jù)的比較 根據(jù)ABCB1基因型對入組患者進行分組，其中野生型49例，突變型66例。結果(表3)表明：兩組患者基線數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學意義。

表3 不同ABCB1基因型患者基線數(shù)據(jù)的比較

在入組的115例患者中，ABCB1野生型49例,突變型66例(表4)。

2.3 不同組別患者抗血小板藥物抑制率、血小板功能(MAADP)及神經(jīng)功能的變化 不同CYP2C19基因型間的比較：不同CYP2C19基因型患者血小板藥物抑制率、MAADP及神經(jīng)功能變化的中位數(shù)組間差異無統(tǒng)計學意義(表5)。

不同ABCB1基因型間的比較：不同ABCB1基因型患者的血小板藥物抑制率、MAADP及神經(jīng)功能變化的中位數(shù)組間差異無統(tǒng)計學意義(表5)。

表4 各基因型臨床分布情況 (n,%)

2.4 不同突變基因數(shù)量患者間血小板藥物抑制率、MAADP及神經(jīng)功能變化的比較 根據(jù)突變基因數(shù)量，將入組患者分為A、B、C組，其中A組23例(20.0%)，B組50例(43.5%)，C組42例(36.5%)。結果(表6)表明：不同突變基因數(shù)量患者間血小板藥物抑制率、MAADP及神經(jīng)功能變化，組間差異無統(tǒng)計學意義。

表5 不同基因型患者抗血小板藥物抑制率、MAADP及神經(jīng)功能變化的中位數(shù)

Δ:服藥7 d后神經(jīng)功能量表評分與入院時差值

表6 不同突變基因數(shù)量患者間血小板藥物抑制率、MAADP及神經(jīng)功能變化的中位數(shù)

Δ:服藥7 d后神經(jīng)功能量表評分與入院時差值

3 討 論

氯吡格雷是一種重要的噻吩吡啶類抗血小板藥物,其使用顯著減少了缺血性腦血管病的發(fā)生，但對氯吡格雷反應存在顯著個體差異，氯吡格雷抵抗的發(fā)生率約為5%～30%[24]，因此氯吡格雷代謝相關的基因多態(tài)性引起越來越多的臨床醫(yī)生的重視。ABCB1及CYP2C19基因在氯吡格雷代謝中發(fā)揮重要作用，ABCB1基因突變導致氯吡格雷的腸道吸收減少[25]，而CYP2C19基因突變導致其所編碼的參與氯吡格雷生物轉化酶的活性改變[26]，CYP2C19失功能等位基因攜帶者的酶活性降低,從而使氯吡格雷的生物利用度降低,導致氯吡格雷治療后血小板高反應性，從而增加不良缺血事件的發(fā)生[11,27]。

ABCB1和CYP2C19基因突變類型及發(fā)生頻率在不同種族及地域間存在差異。本研究中，CYP2C19*2 和CYP2C19*3的出現(xiàn)頻率分別為34.3%和4.8%。Scott等[28]的一項研究發(fā)現(xiàn)，在CYP2C19基因突變類型中，*2是最常見的失功能等位基因，其在高加索人、非裔美國人及亞洲人中出現(xiàn)的頻率分別約為12%、15%、29%～35%，在大多數(shù)種群*3等位基因出現(xiàn)頻率低于1%，然而，在亞洲人群中其出現(xiàn)頻率亦相當高，約為2%～9%，與本研究結果一致。Fung等[29]發(fā)現(xiàn)在亞洲人中ABCB1基因突變發(fā)生率高達69.9%～83.2%，本研究結果顯示ABCB1基因突變發(fā)生率為57.4%，接近上述研究結果。

本研究對115例缺血性卒中患者進行CYP2C19基因型和血小板抑制率的檢測以及急性期神經(jīng)功能變化的評估,各代謝型氯吡格雷血小板藥物抑制率及神經(jīng)功能變化均無顯著差異。但既往諸多研究顯示CYP2C19失功能等位基因(中、慢代謝型)攜帶者對氯吡格雷反應性降低，氯吡格雷抗血小板聚集作用減弱[30-33]，與本研究結果并不一致。但也有一些研究與本研究結果相符。其中2010年一項隨機對照試驗結果顯示在急性冠脈綜合征或房顫患者中，不管患者是否攜帶CYP2C19失功能等位基因，氯吡格雷降低主要終點事件發(fā)生率是相似的[34]。2015年的一項Meta分析結果顯示接受氯吡格雷治療的冠心病患者中，攜帶CYP2C19失功能等位基因并未使心血管事件發(fā)生率增加[35]。在最近一項研究[36]中，對接受阿司匹林聯(lián)合氯吡格雷的急性冠脈綜合征患者進行1年隨訪發(fā)現(xiàn)CYP2C19基因型對患者臨床預后并無影響。尹書會等[37]對251例缺血性腦卒中服用氯吡格雷的患者進行CYP2C19基因型檢測，并利用血栓彈力圖檢測血小板藥物抑制率，比較不同基因型患者的血小板抑制率及氯吡格雷敏感情況，各代謝型間血小板藥物抑制率及氯吡格雷敏感情況的差異均無統(tǒng)計學意義。

本研究還比較了不同ABCB1基因型患者的血小板抑制率及神經(jīng)功能變化，各基因型氯吡格雷血小板抑制率及神經(jīng)功能變化無顯著差異。關于ABCB1基因多態(tài)性對氯吡格雷抗血小板聚集作用的影響，目前國內外研究尚無統(tǒng)一定論。有研究[25]顯示ABCB1基因突變使血液中氯吡格雷及其活性和非活性代謝產(chǎn)物濃度降低，從而使血小板抑制率降低。然而，多項研究所得出的結論與本研究相似，其中一項納入500例服用氯吡格雷的急性冠脈綜合征的中國患者的研究結果顯示ABCB1基因型不影響氯吡格雷的抗血小板作用強度[38]；Su等[18]對303例服用氯吡格雷的缺血性腦卒中患者進行血小板聚集率檢測，根據(jù)血小板聚集率分為氯吡格雷抵抗組和氯吡格雷敏感組，結果顯示ABCB1基因型與氯吡格雷抵抗無關；Karaz＇niewicz-ada等[39]也發(fā)現(xiàn)ABCB1基因多態(tài)性和血小板抑制率間并無相關性；甚至一項Meta分析[40]結果顯示，在服用氯吡格雷的亞洲人群中，ABCB1基因突變減弱血小板活性，從而使出血風險增加。

由于既往研究未分析ABCB1和CYP2C19兩種基因聯(lián)合突變對氯吡格雷療效的影響，本研究比較了含不同突變基因數(shù)量患者間的血小板抑制率及急性期神經(jīng)功能變化情況，各組間無顯著差異。有研究顯示在接受阿司匹林+氯吡格雷聯(lián)合抗血小板的急性冠脈綜合征患者中，同時攜帶CYP2C19失功能基因及ABCB1突變基因的患者血栓形成事件發(fā)生率更高[13]，但針對缺血性腦卒中，關于ABCB1及CYP2C19基因型聯(lián)合突變對氯吡格雷療效的影響尚未見報道，還需進一步研究探討。

綜上所述，關于ABCB1及CYP2C19基因型對氯吡格雷療效的影響尚存在爭議，分析其原因如下：參與氯吡格雷代謝的因素較多，可能還有一些較關鍵的因素及機制尚未被發(fā)現(xiàn)；評估血小板功能的方法眾多，且其檢測原理、易受影響的因素各不相同,不同研究所采用的方法亦不同，這可能會導致不同研究結果間的差異。從本研究結果看，對于服用氯吡格雷的急性動脈粥樣硬化性腦梗死患者，不同ABCB1及CYP2C19基因型間的血小板抑制率及急性期神經(jīng)功能變化并無顯著差異，但對于該人群長期預后的影響仍需要進一步的研究。