白細胞介素12在肝癌中的差異表達及生物信息學分析*

張 莉 翟 蕙 李文靜 劉傳苗

蚌埠醫學院第一附屬醫院感染性疾病科，安徽省蚌埠市 233000

肝細胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是一種惡性程度高、易轉移、易復發的惡性腫瘤，危害人體健康，其致死率在各種癌癥死亡率中排第三位[1]。近年來，越來越多的研究關注于肝細胞肝癌發生的分子機制，但目前仍然尚不十分清楚。由于肝細胞癌早期癥狀和臨床體征不明顯，并且由于其發病具有隱匿性、病程進展迅速，因而大多數患者在確診時已是癌癥晚期，所以預后差、生存率低。因此，提高早期診斷率對于提高患者的預后具有重要意義。開展肝癌早期診斷和治療的關鍵分子機制的研究對于降低肝癌死亡率具有重要意義。白細胞介素12(Interleukin-12，IL-12)是趨化因子家族的一種細胞因子，具有免疫調節作用。其是由一條35kDa(被稱為p35)和一條40kDa(被稱為p40)的肽鏈通過二硫鍵連接在一起，組成的異源二聚體。其中p35鏈由IL12A(Interleukin 12A)基因編碼，p40鏈由IL12B(Interleukin 12B)基因編碼。目前IL-12被認為是潛在的抗腫瘤免疫治療的有效細胞因子之一。其抑癌機制主要是通過對腫瘤的微環境進行免疫調節，抑制腫瘤周圍血管的生成，進而減少腫瘤細胞的營養供應[2]。目前對于IL-12在肝癌中的研究較少，還沒有對IL12A和IL12B基因在肝癌中的系統分析，因此本研究在通過生物信息學的方法分析IL-12相關基因在肝癌中的表達情況以及對癌癥預后的價值。

1 資料與方法

1.1 數據來源 本研究所分析的數據來源于腫瘤基因組圖譜計劃(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數據庫中的肝癌樣本(Liver Hepatocellular Carcinoma，LIHC)的數據[3]。LIHC數據包括了371例原發性肝癌組織樣本和50例正常肝組織樣本。其中肝癌患者包括男245例，女117例；21～40歲患者27例，41～60歲患者140例，61～80歲患者181例，81～100歲患者10例；肝癌Ⅰ期患者168例，Ⅱ期84例，Ⅲ期82例，Ⅳ期6例。因為部分患者缺失性別信息、年齡信息，或者無法準確進行癌癥分期，所以沒有納入分組統計分析中。

1.2 研究方法 本研究使用Ualcan(http://ualcan.path.uab.edu)在線工具[4]分析肝癌組織和正常肝臟組織IL12A和IL12B的表達差異，對于存在差異表達的基因進行不同性別、年齡、癌癥分期的分組表達分析，同時分析其甲基化水平的差異。對于有差異表達的基因，分析與之相關表達的基因，同時對共表達基因使用DAVID在線分析工具(https://david.ncifcrf.gov/)[5]做GO(Gene Ontology)富集分析、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析。對于差異表達的基因，使用Kaplan-Meier生存分析法分析患者的生存時間及生存率，并繪制表達水平與預后生存曲線。

1.3 統計學方法 IL12A和IL12B基因的表達水平用四分位數進行表示，中間的四分位數就是該基因表達的中位數，基因表達數據在文章中以“中位數(四分位間距)”，即[M(P25，P75)]格式表示，在圖形中以箱線圖的形式表示，對于多組之間的比較采用秩和檢驗。對于GO富集分析和KEGG通路分析采用Fisher精確檢驗。對于不同表達水平的生存差異，采用Log-rank檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。在文中分別以*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

2 結果

2.1 IL12A和IL12B在肝癌組織和正常肝臟組織的表達情況 基于TCGA數據庫，IL12A基因在正常的肝臟組織中的轉錄本表達量(Transcript per million，TPM)為0.033(0.018，0.056)，在肝癌組織中的轉錄本表達量為0.077(0.028，0.162)；肝癌組織中IL12A基因的表達水平顯著高于正常肝臟組織(P<0.001)，見圖1A。IL12B基因在正常的肝臟組織中的轉錄本表達量為0.000(0.000，0.010)，在肝癌組織中的轉錄本表達量為0.010(0.000，0.029)；IL12B基因在肝癌組織和正常肝臟組織的表達量沒有顯著差異(圖1B)。因為沒有檢測到IL12B基因在肝癌組織和正常肝臟組織的差異表達，所以在后續的分析中主要以IL12A基因為主。

2.2 IL12A基因在不同分組肝癌患者中的表達情況 基于LIHC樣本的數據，IL12A基因在男性患者肝癌組織的轉錄本表達量為0.075(0.029，0.147)，在女性患者中的表達量為0.079(0.027，0.175)；IL12A的表達水平在二者之間沒有顯著性差異(圖2A)。IL12A在21～40年齡組的肝癌組織的表達量為0.110(0.048，0.184)，在41～60年齡組的表達量為0.086(0.039，0.188)，在61～80年齡組的表達量為0.068(0.023，0.147)，在81～100年齡組的表達量為0.137(0.054，0.187)；IL12A的表達僅在21～40年齡組與41～60年齡組之間存在顯著差異(P<0.01)，見圖2B。IL12A在Ⅰ期肝癌組織的表達量為0.074(0.033，0.161)，Ⅱ期肝癌組織的表達量為0.084(0.028，0.185)，Ⅲ期肝癌組織的表達量為0.106(0.028，0.199)，Ⅳ期肝癌組織的表達量為0.074(0.063，0.127)；IL12A的表達分別在Ⅰ期與Ⅲ期(P<0.05)、Ⅱ期與Ⅳ期(P<0.01)、Ⅲ期與Ⅳ期(P<0.01)存在顯著差異(圖2C)。

2.3 IL12A在肝癌組織和正常肝臟組織的甲基化情況 基于LIHC樣本中的數據，IL12A基因在正常的肝臟組織中的甲基化Beta值(Beta value)為0.037(0.035，0.040)，在肝癌組織中的甲基化Beta值為0.030(0.032，0.035)；肝癌組織中IL12A基因的甲基化水平顯著低于正常肝臟組織(P<0.01)，見圖3。

A：不同性別肝癌患者IL12A基因的表達水平 B：不同年齡肝癌患者IL12A基因的表達水平 C：不同分期肝癌患者IL12A基因的表達水平

2.4 在肝癌組織中與IL12A共表達基因的GO富集分析 基于TCGA數據庫，檢索到1 914個與IL12A共表達基因，其中Pearson相關系數(Pearson Correlation Coefficient)≥0.4的共表達基因有376個。對于IL12A和這376個共表達的基因利用DAVID工具進行GO富集分析。通過GO富集分析，發現在生物過程方面，共表達基因主要富集在細胞成分組織、生殖過程、代謝過程、生物過程負調節、細胞增殖、免疫系統反應、應激反應等方面；在細胞組成方面共表達基因主要與膜封閉腔、蛋白復合物、細胞器、超分子配合物等組成有關；在分子功能方面，共表達基因主要富集在結合、轉錄調節活性、催化活性、分子載體活性、分子功能調節等方面(圖4)。

2.5 在肝癌組織中與IL12A共表達基因的KEGG通路分析 對于IL12A和與其共表達的376個基因(相關系數≥0.4)，使用DAVID工具進行KEGG通路分析。結果顯示，共表達基因主要富集在接合體、細胞周期、DNA復制、RNA轉運、真核生物中的核糖體生物發生、泛素介導的蛋白質水解等的相關通路方面。表達差異基因KEGG通路富集結果見表1。

2.6 IL12A 表達與肝癌預后的關系 基于LIHC樣本中的數據，使用Kaplan-Meier生存分析法分析肝癌患者IL12A基因表達高低水平與生存時間及生存率之間的關系，并繪制肝癌患者預后生存曲線圖(圖5)。結果顯示，IL12A基因高表達的肝癌患者的生存率明顯低于IL12A基因低表達患者的生存率(P=0.009 1)。

表1 IL12A與其共表達基因的KEGG通路分析結果

圖5不同IL12A表達情況的肝癌患者生存曲線

3 討論

本研究結果表明，在肝癌組織中IL12A基因的表達水平顯著高于正常的肝臟組織，而IL12B基因在二者之間表達情況沒有顯著性差異。對于IL12A基因，其在肝癌組織中的表達情況與性別沒有相關性；雖然在21～40歲年齡組與41～60歲年齡組之間，發現存在表達差異，但是并沒有在其他年齡組別之間發現類似現象。在肝癌Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期之間發現IL12A的表達有差異，但是同Ⅳ期比較，并沒有發現差異表達情況，這可能是由于Ⅳ期患者數目較少(僅為6例)的原因造成的。分析IL12A基因的甲基化水平，可以發現在肝癌組織中的甲基化水平顯著低于正常肝臟組織的水平。目前的研究結果表明，DNA低甲基化是在腫瘤發生發展中的一種常見的表觀遺傳異常，DNA被甲基化通常會抑制基因的表達。本研究發現在肝癌組織IL12A的甲基化水平較正常肝臟組織低，而此時IL12A在肝癌組織中的表達水平則明顯升高。

IL-12由35kDa(被稱為p35)和40kDa(被稱為p40)的兩條肽鏈組成。通常情況下，在細胞中p40的量遠超出p70的量，但是p40同源二聚體沒有生物學活性；同時研究也表明單獨的p35也不具有生物學活性，但p35卻是合成p70的限速因子[6]。由此可見，在本研究中發現的IL12A在肝癌組織中的高表達對于肝癌病情的發生、發展有一定的影響。IL-12的生物學活性是通過T細胞和NK細胞上的IL-12受體所介導發揮的，其自身及其所誘導的細胞因子與其他細胞因子之間的相互作用是一個復雜的網絡調控系統。IL-12獨特的細胞效應主要是由于信號傳導與轉錄激活因子-4(Signal transducers and activators of transcription 4， STAT4)的活化所產生的。STAT4可以調節IL-12與IL-23之間的平衡，并可以通過控制輔助性T細胞1和輔助性T細胞17的活性影響炎癥疾病的發生與發展[7]。其他的研究結果也表明STAT家族中的另一個因子——STAT3也同IL-12一起在肝癌的發病、發展中起到作用。IL-12可誘導肝癌細胞發生自噬現象，這種自噬的機制可能與抑制STAT3信號通路有關[8]。

在癌癥治療后，患者的生存率受到多方面的因素影響，例如患者自身情況、腫瘤分期、治療相關因素等，所以在分析肝癌發生、發展機制以及預后機理時要考慮到多條代謝通路的共同作用，同時要考慮到細胞因子之間相互作用和調節平衡，以及相應的應答水平。在本研究中，通過GO富集分析和KEGG通路分析發現IL12A共表達的基因主要參與了細胞增殖、代謝過程、免疫反應、應激反應、生物黏附、細胞殺傷等分子生物學過程，并參與了DNA復制、RNA轉運、細胞周期調節、蛋白水解、錯配修復等生物學通路。由此可見，肝細胞癌癥的發生、發展是由多基因發生表達變化所引起的多方面生物過程和多條代謝通路的共同變化所導致的。

綜上所述，IL12A基因在肝癌組織中表達量高，并且其與肝細胞癌癥的發生、發展密切相關。因此，IL12A可以作為肝癌診斷篩選、預后效果預測的標志物之一。