蘆薈大黃素對便秘小鼠結(jié)腸肌電表達(dá)的影響

王健 朱甲婧 孫嘉翊 王婷 杜愛林

便秘是一種常見的胃腸運(yùn)動障礙性疾病。由于各種因素(飲食，年齡，地理分布，居住區(qū)域，職業(yè)等)影響，便秘發(fā)病率近幾年來呈上升趨勢[1]，大黃素具有抗腫瘤活性、抗微生物生長作用、免疫抑制作用和瀉下利尿作用[2]。蘆薈大黃素(aloe emodin，AE)與大黃素是同分異構(gòu)體，AE也有抗腫瘤活性、抗菌活性、免疫抑制和瀉下作用[3]。目前現(xiàn)有文獻(xiàn)僅局限于腫瘤活性，對瀉下有關(guān)的作用在國內(nèi)還未報(bào)道。已有研究表明：P物質(zhì)(P substance，SP)、血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)可作為作為胃腸運(yùn)動調(diào)節(jié)中重要的興奮性和抑制性胃腸肽，廣泛分布在胃腸道中[4]。SP是興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，能刺激腸道運(yùn)動并抑制胃腸道黏膜分泌[5]。血管活性腸肽是腸神經(jīng)系統(tǒng)(ENS)中的一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，能夠松弛胃腸道，是參與腸蠕動調(diào)節(jié)的重要蛋白。SP是興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，能刺激腸道運(yùn)動并抑制胃腸道黏膜分泌[5]。因此本課題將進(jìn)一步研究AE對結(jié)便秘小鼠腸組織中SP及VIP表達(dá)的影響，探究其治療便秘的作用機(jī)制，同時(shí)為新藥開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動物 取30只小鼠，平均分為三組，對照組、模型組、AE組，10只/組。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 復(fù)方地芬諾酯片(江蘇平光制藥有限責(zé)任公司，批號：170032，2.5 g/片)，硫酸鋇混懸液(美侖生物，CAS號：7727-43-7)，烏拉坦腹腔注射麻醉(0.3 mL/只)，AE(美侖生物，批號：N1026A)等。

1.3 主要儀器 BL-420F生物機(jī)能試驗(yàn)系統(tǒng)，自制銅絲電極直徑0.5 mm，長度4 mm，注射器、灌胃針頭、電子秤、電熱板、計(jì)時(shí)器、眼科剪、刻度尺、鑷子、量筒、燒杯等。

1.4 造模 取30只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，測量每只小鼠連續(xù)4 d飲水量及大便量，計(jì)算此批小鼠正常每日飲水量均數(shù)，得出每日大便量的正常范圍，然后開始限水加給藥物進(jìn)行造模。給藥方法：將藥物混入蒸餾水中給小鼠進(jìn)行灌胃。給藥量：復(fù)方地芬諾酯片25 mg/kg(小鼠用量按成人用量的9倍計(jì)算)。限水水量：于第1～2天給前1周平均水量的1/6，第3～6天給前1周平均水量的1/3，取整數(shù)值。為了避免再次灌胃操作對小鼠排便的影響，我們對小鼠實(shí)行普通飲水瓶手持輔助飲水方法。2次/d給水。對照組灌胃等量的蒸餾水，排除灌胃操作帶來的影響干擾。記錄每日排便量、粒型大小、干燥程度。以糞便干燥、粒形縮短、排便費(fèi)力、日排量低于參考值范圍為診斷小鼠便秘的標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 對小鼠腸道傳輸功能的檢測 對小鼠大便情況的測定：配制140%的硫酸鋇混懸液。停藥7 d后，禁食14 h，用硫酸鋇混懸液按1 mL/100 g的劑量給小鼠灌胃并準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，給藥后觀察小鼠第一次排出白便的時(shí)間，連續(xù)觀察6 h，記錄小鼠排便的粒數(shù)，糞便的干重(收集的糞便在25～27 ℃的電熱板上烤6 h)。結(jié)腸肌電生理變化測定：首先禁食小鼠24 h，注射20%烏拉坦腹腔麻醉(0.3 mL/只)，而后將其仰臥置于手術(shù)臺，常規(guī)消毒，縱行沿下腹部正中切開1.5 cm，顯露回盲部，于距盲腸約1 cm(結(jié)腸近段)放置一對銅絲電極(兩電極插入漿肌層內(nèi)，彼此相距0.5 cm)，導(dǎo)線經(jīng)切口引出接BL-410F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，于30 min后開始記錄。靈敏度選擇：增益倍數(shù)放大500倍、高頻濾波為20 Hz、時(shí)間常數(shù)0.001 s，連續(xù)記錄45 min，重復(fù)3次。

1.6 結(jié)腸肌電活動參數(shù)分析 以3 min為1個時(shí)間段，分別記錄比對振幅和頻率的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差以及變異系數(shù)。

慢波振幅變異系數(shù)(%)＝慢波振幅標(biāo)準(zhǔn)差/慢波振幅均值×100%

慢波頻率變異系數(shù)(%)＝慢波頻率標(biāo)準(zhǔn)差/慢波頻率均值×100%

1.7 免疫組織化學(xué)技術(shù) 各組小鼠均只給予水24 h，對于小鼠進(jìn)行麻醉處死，通過腹腔注射的方法，注射5%水合氯醛(0.1 mL/10 g)，之后取小鼠近段結(jié)腸，用4%的多聚甲醛溶液固定小鼠的組織，一定梯度的乙醇脫水，石蠟包埋，切片，切片厚度為5 μm。常規(guī)脫蠟復(fù)水，采用DAB染色，把二抗稀釋為200倍，最后使用樹膠封存玻片晾干。在顯微鏡下觀察SP和VIP的染色情況，陽性細(xì)胞的判定方法，以細(xì)胞中存在有被染為褐色的顆粒為標(biāo)志。選擇合適的視野，避開重疊或者不完整的，用Image pro-Plus 6.0軟件統(tǒng)計(jì)分析每個視野的平均光密度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用照相系統(tǒng)在光鏡下采集免疫組化圖片，用Image pro-Plus 6.0軟件統(tǒng)計(jì)平均光密度值，SP和VIP表達(dá)情況用Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用(±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 三組小鼠排便情況的測定(表1) 建模后，AE組及模型組小鼠的糞便較對照組小鼠的糞便重量減輕、濕度降低、硬度增大。模型組小鼠及AE組小鼠6 h內(nèi)排便粒數(shù)較對照組較大幅度減小，第一次排紅便時(shí)間長，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表1 三組小鼠排便情況的測定(±s)

表1 三組小鼠排便情況的測定(±s)

注：與對照組比較，#P＜0.01。

組別例數(shù)第一次排紅便時(shí)間/min 6 h排便粒數(shù)對照組10174.38±7.5973.89±6.56模型組10379.56±23.17#29.51±6.02#AE組10220.12±13.87#65.25±5.77#

2.2 三組小鼠結(jié)腸肌電活動(表2，圖1) 三組小鼠的結(jié)腸慢波呈正弦波樣曲線。三組小鼠的結(jié)腸慢波表現(xiàn)與正弦波樣曲線相接近。模型組結(jié)腸慢波頻率為(47.97±2.63)次/min，與對照組(43.75±0.69)次/min相比明顯加快，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，AE組結(jié)腸慢波頻率與模型組比較明顯減慢，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；模型組結(jié)腸慢波頻率變異系數(shù)(6.02±0.23)%，與對照組(1.83±0.38)%相比明顯增大(P＜0.01)，AE組小鼠頻率變異系數(shù)(2.77±0.19)%，與模型組相比更趨于正常(P＜0.01)；模型組結(jié)腸慢波振幅(0.05±0.03)mV，與對照組(0.16±0.03)mV相比顯著減少(P＜0.01)，AE組振幅(0.13±0.03)mV，與模型組相比明顯回升(P＜0.01)；模型組結(jié)腸慢波振幅變異系數(shù)(62.79±1.71)%，與對照組(10.13±0.55)%相比明顯增大(P＜0.01)，AE組小鼠振幅變異系數(shù)(25.31±1.97)%，與模型組相比明顯減小(P＜0.01)。

表2 三組小鼠結(jié)腸慢波頻率、振幅比較(±s)

表2 三組小鼠結(jié)腸慢波頻率、振幅比較(±s)

注：與模型組比較，#P＜0.01。

組別例數(shù)頻率/(次·min-1)頻率變異系數(shù)/%振幅/mV振幅變異系數(shù)/%對照組1043.75±0.69#1.83±0.38#0.16±0.03#10.13±0.55#模型組1047.97±2.636.02±0.230.05±0.0362.79±1.71 AE組1043.84±1.19#2.77±0.19#0.13±0.03#25.31±1.97#

圖1 三組小鼠結(jié)腸肌電圖(A：正常組小鼠結(jié)腸肌電圖；B：模型組小鼠結(jié)腸肌電圖；C：AE組小鼠結(jié)腸肌電圖)

2.3 三組小鼠結(jié)腸SP表達(dá)變化(圖2A～2C，表3)與正常對照組比較，模型組小鼠結(jié)腸SP表達(dá)明顯降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；AE組與模型組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

圖2A 對照組小鼠結(jié)腸SP 陽性表達(dá)免疫組化DAB染色(×40)

圖2B 模型組小鼠結(jié)腸SP 陽性表達(dá)免疫組化DAB染色(×40)

圖2C AE組小鼠結(jié)腸SP 陽性表達(dá)免疫組化DAB染色(×40)

表3 三組小鼠結(jié)腸SP 表達(dá)變化(±s)

表3 三組小鼠結(jié)腸SP 表達(dá)變化(±s)

注：與模型組比較，*P＜0.01。

組別例數(shù)結(jié)腸中SP平均光密度值對照組100.045 2±0.007 0*模型組100.023 1±0.004 9 AE組100.040 5±0.002 2*

2.4 三組小鼠結(jié)腸VIP表達(dá)變化(圖3A～3C，表4)與正常對照組比較，模型組表達(dá)明顯降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；AE組與模型組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

圖3A 對照組結(jié)腸組織VIP 的陽性表達(dá)免疫組化DAB染色(×40)

圖3B 模型組結(jié)腸組織VIP 的陽性表達(dá)免疫組化DAB染色(×40)

圖3C AE組結(jié)腸組織VIP 的陽性表達(dá)免疫組化DAB染色(×40)

表4 三組小鼠結(jié)腸組織中VIP 平均光密度值(x±s)

3 討論

便秘是一種常見的胃腸運(yùn)動障礙性疾病。在臨床中，便秘是一種很常見的癥狀，但目前國內(nèi)外文獻(xiàn)并沒有對其病因有明確說明和解釋。

有研究表明[6]，便秘患者結(jié)腸推進(jìn)性收縮波數(shù)目和收縮幅度均有所減低，糞便在腸道有所潴留。結(jié)腸能促進(jìn)排泄糞便，便秘常被認(rèn)為是結(jié)腸動力異常引起的。結(jié)腸的肌電動作電位是在慢波的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的，與平滑肌收縮頻率相同，是推進(jìn)性運(yùn)動的核心動力。結(jié)腸的動力情況可由結(jié)腸肌電活動，電生理指標(biāo)進(jìn)行客觀顯示。研究表明：慢波作為可控制腸道收縮節(jié)律的一種周期性電活動是相對規(guī)律而穩(wěn)定的，腸道收縮或否，慢波始終存在[7]。

本實(shí)驗(yàn)通過使用復(fù)方地芬諾酯建造小鼠的便秘模型，用AE對小鼠進(jìn)行灌胃治療1周后，結(jié)果顯示：模型組與對照組小鼠比較，6 h大便量減少，推動率降低，說明便秘模型建立成功。而AE組與模型組相比，第一次排紅便時(shí)間減少，6 h大便量增多，推動率增加，說明AE對便秘小鼠有通便的作用。模型組與對照組小鼠相比，慢波振幅減少且慢波振幅變異系數(shù)增大，慢波頻率增快且慢波頻率變異系數(shù)增大，振幅和頻率皆有極大差異。該現(xiàn)象的發(fā)生提示便秘有可能是因?yàn)閯幼麟娢划a(chǎn)生受阻從而削弱了腸道的傳輸能力，而AE組與模型組小鼠相比，其慢波頻率減少，慢波振幅小幅度上升。此外，為了衡量節(jié)律的穩(wěn)定性，我們應(yīng)用了變異系數(shù)這一參數(shù)來反映同組小鼠不同時(shí)間段振幅和頻率的差異[8]。結(jié)果 顯示，便秘小鼠的慢波振幅變異系數(shù)及慢波頻率變異系數(shù)與對照組相比均有所增長，該結(jié)果提示便秘小鼠的結(jié)腸肌電生理活動出現(xiàn)了一定程度上的紊亂。AE作用于便秘小鼠后其慢波振幅變異系數(shù)及慢波頻率變異系數(shù)較之前明顯趨于正常，提示AE對增加便秘小鼠的結(jié)腸推進(jìn)性收縮波數(shù)目有一定的作用。收縮幅度的提升可使糞便在結(jié)腸中排泄的速度加快，能有效緩解結(jié)腸的動力異常。但AE在有效改善便秘的同時(shí)，是否能夠長久持續(xù)穩(wěn)定地增加收縮波的數(shù)目而導(dǎo)致腸道收縮節(jié)律的紊亂，目前尚無定論，仍需進(jìn)一步研究。

SP為一種重要的神經(jīng)肽，廣泛地分布于腸神經(jīng)系統(tǒng)和整個胃腸道，既可以激素的形式，也可作為神經(jīng)遞質(zhì)參與胃腸道運(yùn)動的調(diào)控[5]。在腸道神經(jīng)叢及神經(jīng)元中存在著SP這種蛋白，它作為一種具有興奮作用的神經(jīng)遞質(zhì)，能夠調(diào)節(jié)腸道的運(yùn)動。一些研究者發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生便秘的原因和SP的多少有關(guān)系，且SP越少較容易產(chǎn)生便秘[9-10]。SP屬于胃腸肽中的速激肽族，具有強(qiáng)烈地促進(jìn)消化道平滑肌收縮、刺激結(jié)腸黏膜分泌水和電解質(zhì)，促進(jìn)胃腸蠕動的作用。已有研究表明，80%的便秘患者結(jié)腸平滑肌中缺乏SP[11]。

VIP是腸神經(jīng)系統(tǒng)中最具代表性而且研究得比較深入的神經(jīng)遞質(zhì)，在胃腸調(diào)節(jié)中起重要的作用。其受體廣泛分布于人和動物的多種組織器官上[12]。VIP是腸道神經(jīng)系統(tǒng)主要的抑制性遞質(zhì)。VIP是廣泛存在的腦腸肽，在消化系統(tǒng)中十二指腸和結(jié)腸含量最高[13]，能松弛腸道平滑肌，抑制胃腸的運(yùn)動[12]。VIP與結(jié)腸的節(jié)段非推進(jìn)性運(yùn)動有關(guān)，參與調(diào)節(jié)腸道動力及腸黏膜的機(jī)械化學(xué)免疫屏障[14]。VIP作為一種多效性作用的神經(jīng)遞質(zhì)，具有擴(kuò)張血管、降低血壓的特點(diǎn)[15]，對消化道平滑肌的收縮產(chǎn)生抑制作用[16]。VIP濃度降低，可能引起結(jié)腸出現(xiàn)過度的節(jié)段性蠕動，使有效推動運(yùn)動減弱。由于VIP濃度異常改變，使腸道正常運(yùn)動生化功能的完整性被破壞，腸道運(yùn)動功能失調(diào)，從而引起便秘[5]。

結(jié)腸的運(yùn)動形式比較復(fù)雜，結(jié)腸的節(jié)段性運(yùn)動使腸內(nèi)容物得到混合攪拌，推進(jìn)性運(yùn)動將腸內(nèi)容物從一個結(jié)腸段推送到相鄰的遠(yuǎn)端結(jié)腸。陶春虹[16]研究表明，枳實(shí)能明顯提高慢傳輸型便秘腸神經(jīng)遞質(zhì)SP和VIP含量，促進(jìn)腸運(yùn)動。實(shí)驗(yàn)便秘模型組SP、VIP含量明顯低于空白對照組(P＜0.01)，便秘模型小鼠腸道SP含量降低提示便秘小鼠的腸道收縮功能減弱，這可能是導(dǎo)致結(jié)腸動力減弱而發(fā)生便秘的原因之一，便秘模型小鼠腸道VIP含量降低提示VIP 表達(dá)降低使結(jié)腸階段性蠕動增強(qiáng)，導(dǎo)致有效推動性運(yùn)動減弱，從而引起大便排出困難。

AE對模型小鼠肌間神經(jīng)叢SP、VIP含量增加有明顯的促進(jìn)作用，表明大黃素的促腸道動力作用與結(jié)腸SP、VIP分布增加存在著密切關(guān)系，可能與本組方有促進(jìn)腸神經(jīng)叢結(jié)構(gòu)和功能恢復(fù)有關(guān)，其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。大黃素是否對結(jié)腸其他胃腸激素、酶類及神經(jīng)遞質(zhì)也產(chǎn)生影響，還需作更深入的研究。本研究結(jié)果為大黃素的臨床應(yīng)用提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。