骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)在非霍奇金淋巴瘤患者骨髓侵犯診斷中的價值比較

張巧梅，席大力，康 成，李燕平

(蘭州大學(xué)第一醫(yī)院 a.血液科，b.病理科，c.檢驗科，蘭州 730000)

非霍奇金淋巴瘤 (non-Hodgkin′s lymphoma，NHL)是一種常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，是淋巴細(xì)胞分化過程中的克隆性增生，90%的NHL是成熟B細(xì)胞淋巴瘤，患者發(fā)病的中位年齡為50歲[1]。診斷時通過骨髓活組織檢查評估NHL骨髓侵犯的發(fā)生率為30%～50%，不同病理類型NHL骨髓侵犯的發(fā)生率差異較大，其中B-NHL骨髓侵犯的發(fā)生率高于T-NHL[2-3]。而NHL患者骨髓是否受到侵犯是NHL分期的重要組成部分，故及早發(fā)現(xiàn)NHL侵犯骨髓對NHL患者的分期、療效及預(yù)后評估具有重要的臨床價值。由于淋巴瘤細(xì)胞侵犯骨髓的復(fù)雜性及淋巴瘤細(xì)胞形態(tài)的多樣性，骨髓活組織檢查為主要的診斷方法，目前其為診斷淋巴瘤侵犯骨髓的金標(biāo)準(zhǔn)，但還需要輔助其他檢查(流式細(xì)胞術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù))進行精確診斷[4]。流式細(xì)胞術(shù)免疫檢測是對群體細(xì)胞中每個細(xì)胞是否表達特定抗原進行分型，是必不可少的診斷步驟。流式細(xì)胞術(shù)分析骨髓是否受到淋巴瘤細(xì)胞的侵犯主要通過輕鏈限制性檢測和抗原錯譯表達來判斷。本研究主要分析骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)檢測在NHL患者骨髓侵犯診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取 2015年6月 至2018年11月蘭州大學(xué)第一醫(yī)院收治的NHL疑似骨髓侵犯患者150例。其中，男93例、女57例；年齡3～92歲，中位年齡58歲。B細(xì)胞淋巴瘤127例，T細(xì)胞淋巴瘤23例。以骨髓活組織檢查為NHL骨髓侵犯診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。所有患者的淋巴瘤病理診斷參照世界衛(wèi)生組織2008年造血和淋巴組織腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)[5]。臨床分期參照Ann-Arbor分期[6]： Ⅰ 期7例， Ⅱ 期30例，Ⅲ期35例，Ⅳ期78例。其中，57例患者有不明原因的反復(fù)發(fā)熱(經(jīng)常體溫38 ℃以上)、盜汗及無其他原因體重減輕。

1.2方法 用2%利多卡因2～4 mL局部麻醉后于患者髂(前)后上棘穿刺。先行骨髓穿刺術(shù)，抽吸0.2 mL骨髓液涂片6張，更換10 mL無菌注射器，抽取骨髓液1 mL經(jīng)乙二胺四乙酸二鉀抗凝，進行流式細(xì)胞術(shù)檢查。

1.2.1骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查 選擇制作良好的骨髓涂片，進行瑞氏-姬姆薩染色，然后用油鏡(×1 000)在體尾交界處進行有核細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察并分類計數(shù)200個有核細(xì)胞。淋巴瘤細(xì)胞骨髓侵犯的診斷參考文獻[7]：骨髓涂片有核細(xì)胞分類中淋巴瘤細(xì)胞≥5%者診斷為NHL骨髓侵犯；骨髓涂片有核細(xì)胞分類中淋巴瘤細(xì)胞≥20%者診斷為淋巴瘤細(xì)胞白血病。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢查 采取乙二胺四乙酸二鉀抗凝骨髓標(biāo)本，由同一檢驗師對6色流式細(xì)胞儀進行質(zhì)量控制及標(biāo)準(zhǔn)操作。用直接免疫標(biāo)記法進行免疫分型檢測。儀器為美國BD公司生產(chǎn)的雙激光管FACS-CantoⅡ型流式細(xì)胞儀，使用分析軟件DIVA分析10 000個細(xì)胞抗原的表達情況。采用CD45/側(cè)向角散射設(shè)門圈定異常細(xì)胞群，并通過CD3和CD20的表達情況來區(qū)別瘤細(xì)胞來源于T細(xì)胞系或B 細(xì)胞系，其中B淋巴細(xì)胞淋巴瘤根據(jù)瘤細(xì)胞是否表達CD5、CD10分為4組：CD5+、CD10-常見于慢性淋巴細(xì)胞白血病/小淋巴細(xì)胞淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤、淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤及邊緣帶淋巴瘤等；CD5-、CD10+常見于濾泡性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤等；CD5+、CD10+常見于濾泡性淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤等；CD5-、CD10-常見于邊緣帶淋巴瘤、毛細(xì)胞白血病等,再進一步根據(jù)CD23、CD43、CD123、CD103、CD79鑒別上述疾病。T細(xì)胞淋巴瘤常見于CD3、CD5強度改變，自然殺傷細(xì)胞腫瘤常見CD2、CD7、CD56、CD8、CD16的改變，血管免疫母細(xì)胞T細(xì)胞淋巴瘤常用CD7、CD3表達下降；外周T細(xì)胞淋巴瘤通常有CD5、CD7缺失[8]。兩種方法中任一方法陽性即為聯(lián)合診斷陽性。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料用百分比表示，診斷價值采用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC曲線)評價，ROC曲線下面積越大診斷價值越大，ROC曲線下面積為0.5～0.7表示診斷價值較低，0.7～0.9表示診斷價值中等，0.9以上表示診斷價值較高。

2 結(jié) 果

2.1骨髓活組織檢查結(jié)果 經(jīng)骨髓活組織檢查最終確診骨髓侵犯患者54例，未侵犯患者96例。不同病理類型NHL骨髓侵犯結(jié)果：彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤71例，其中骨髓侵犯15例；濾泡細(xì)胞性淋巴瘤13例，其中骨髓侵犯5例；慢性淋巴細(xì)胞白血病/小淋巴細(xì)胞淋巴瘤13例，其中骨髓侵犯11例；間變大細(xì)胞型淋巴瘤8例，其中骨髓侵犯2例；套細(xì)胞淋巴瘤8例，其中骨髓侵犯3例；淋巴漿細(xì)胞淋巴瘤 7例，其中骨髓侵犯5例；自然殺傷細(xì)胞/T細(xì)胞淋巴瘤7例，其中骨髓侵犯1例；黏膜相關(guān)淋巴組織結(jié)外邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤6例，其中骨髓侵犯1例；邊緣型淋巴瘤4例，其中骨髓侵犯3例；外周T細(xì)胞淋巴瘤4例，其中骨髓侵犯2例；T母細(xì)胞淋巴瘤3例，伴骨髓侵犯；B母細(xì)胞淋巴瘤2例，伴骨髓侵犯；伯基特淋巴瘤1例，伴骨髓侵犯；介于伯基特/彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤不能分類的淋巴瘤、血管免疫母細(xì)胞性T細(xì)胞淋巴瘤、縱隔大B細(xì)胞淋巴瘤各1例，這 3例中未見骨髓侵犯。

2.2骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)和兩種方法聯(lián)合診斷NHL骨髓侵犯的結(jié)果 骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)聯(lián)合檢測的陽性率為30.67%(46/150)，高于單獨骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)[22.67%(34/150)]、流式細(xì)胞術(shù)[27.33%(41/150)]。骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)診斷NHL骨髓侵犯的靈敏度、特異度、約登指數(shù)、正確率、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和陽性似然比均低于流式細(xì)胞術(shù)，陰性似然比高于流式細(xì)胞術(shù)；聯(lián)合檢測的靈敏度、約登指數(shù)和陰性預(yù)測值均高于兩種方法單獨檢測，特異度、陽性預(yù)測值、陽性似然比和陰性似然均低于兩種方法單獨檢測。見表1和表2。

表1 骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)和聯(lián)合診斷NHL骨髓侵犯的結(jié)果 (例)

表2 骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)和聯(lián)合檢測的診斷效能

2.3骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)和兩種方法聯(lián)合評價NHL骨髓侵犯的ROC曲線分析 NHL骨髓侵犯以骨髓病理檢查即骨髓活組織檢查為金標(biāo)準(zhǔn)，繪制骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)和兩種方法聯(lián)合檢測的ROC曲線，見圖1。骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)的ROC曲線下面積為0.763，流式細(xì)胞術(shù)為0.843，兩種方法聯(lián)合檢測為0.853，骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)和兩種方法聯(lián)合檢測的診斷價值中等，且兩種方法聯(lián)合檢測的ROC曲線下面積大于單獨檢測。見表3。

ROC：受試者工作特征

表3 骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)和兩種方法聯(lián)合檢測的ROC曲線下面積及相關(guān)參數(shù)評價

ROC:受試者工作特征

3 討 論

NHL是原發(fā)于淋巴組織的惡性腫瘤，具有很高的侵襲性，可以擴散至全身各組織。由于淋巴組織與血液系統(tǒng)密切相關(guān)，所以骨髓也容易受淋巴瘤細(xì)胞侵犯，表現(xiàn)出不同的癥狀和體征，骨髓浸潤和(或)其他組織侵犯的患者處于Ⅳ期，提示預(yù)后不良[9]。Sheikhpour等[10]報道，西方國家T細(xì)胞淋巴瘤約占所有NHL的12.98%。而Ko等[11]報道，亞洲的T細(xì)胞NHL發(fā)病率高于西方國家，本研究結(jié)果與該結(jié)果一致。NHL侵犯骨髓早期缺乏特異性臨床特征，而NHL是否侵犯骨髓作為淋巴瘤分期的一部分，對早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療淋巴瘤骨髓侵犯患者具有重要的臨床價值。目前，骨髓活組織檢查及免疫組織化學(xué)染色評估仍是檢測淋巴瘤骨髓侵犯的標(biāo)準(zhǔn)方法。近年來，流式細(xì)胞術(shù)分析已成為淋巴瘤骨髓侵犯檢測的常規(guī)方法。雖然流式細(xì)胞術(shù)提供了高靈敏度及更具客觀性的結(jié)果，但其無法代替骨髓病理學(xué)檢查[12]。不同病理類型的淋巴瘤浸潤模式常有所不同。Sovani等[13]對511例淋巴瘤骨髓侵犯患者的浸潤模式進行回顧性分析，將淋巴瘤細(xì)胞浸潤骨髓模式分為彌散型、小梁旁型、間質(zhì)型、結(jié)節(jié)型和竇內(nèi)型。當(dāng)骨髓穿刺涂片有少量淋巴瘤細(xì)胞或骨髓標(biāo)本被外周血稀釋時，很難確認(rèn)NHL骨髓侵犯，然而骨髓活組織檢查能較全面地了解骨髓組織的完整結(jié)構(gòu)，所以確診淋巴瘤骨髓侵犯時骨髓活組織檢查的陽性率明顯高于骨髓涂片[14-15]。骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查操作簡單，取材方便，形態(tài)清晰，且淋巴瘤細(xì)胞均有各自的細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征，當(dāng)骨髓涂片中找到5%以上形態(tài)異常的淋巴細(xì)胞時，可懷疑為淋巴瘤細(xì)胞骨髓侵犯，應(yīng)進一步行骨髓活組織檢查及免疫組織化學(xué)染色以確定骨髓是否受到淋巴瘤細(xì)胞的侵犯[16]。流式細(xì)胞術(shù)主要通過輕鏈限制性檢測和抗原錯譯表達判斷異常細(xì)胞克隆，其根據(jù)免疫表型的特征對淋巴瘤進行分型，且在淋巴瘤診斷及鑒別診斷中具有重要價值。

本研究中，NHL不同病理類型淋巴瘤骨髓侵犯的發(fā)生率與陳青等[17]的研究結(jié)果基本一致；骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)的陽性檢出率分別為22.67%和27.33%，兩種方法聯(lián)合檢測的陽性檢出率為30.67%，這與齊貞光[18]的報道基本一致。本研究中，8例NHL患者骨髓涂片中可見可疑淋巴瘤細(xì)胞<5%，其中4例骨髓活組織檢查及流式細(xì)胞術(shù)均為陰性，再次換部位穿刺骨髓活組織檢查為陽性，4例中2例確診為彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤骨髓侵犯，1例為伯基特淋巴瘤骨髓侵犯,1例為外周T細(xì)胞淋巴瘤骨髓侵犯；另外4例中，2例第3次骨髓活組織檢查為陽性，2例為陰性，表明多次換部位穿刺進行骨髓活組織檢查可提高NHL骨髓侵犯的陽性檢出率。13例NHL患者經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測未發(fā)現(xiàn)淋巴瘤細(xì)胞，而經(jīng)骨髓活組織檢測發(fā)現(xiàn)患者骨髓受到侵犯，流式細(xì)胞術(shù)出現(xiàn)假陰性的原因可能有：①T細(xì)胞淋巴瘤中少量的淋巴瘤細(xì)胞易與反應(yīng)性T細(xì)胞混合，不容易被檢出[19]；②一些大細(xì)胞容易被實驗前處理破壞，如彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞[20]。骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測淋巴瘤細(xì)胞陰性的20例骨髓標(biāo)本經(jīng)骨髓活組織檢查發(fā)現(xiàn)17例NHL患者骨髓受到淋巴瘤細(xì)胞的侵犯，而經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)8例NHL患者骨髓受到淋巴瘤細(xì)胞的侵犯，骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測出現(xiàn)假陰性的原因主要集中在形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為輕度異常的淋巴瘤細(xì)胞，如濾泡細(xì)胞淋巴瘤、套細(xì)胞淋巴瘤，此時應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和骨髓活組織檢查聯(lián)合檢測可以幫助確定淋巴細(xì)胞是否為克隆性改變。研究表明，18F-氟代脫氧葡萄糖正電子發(fā)射計算機斷層顯像/CT具有最佳的陰性預(yù)測值，其可用于檢測小兒淋巴瘤的骨髓浸潤，以減少患兒侵入性檢查[21]。

本研究結(jié)果顯示，骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)診斷NHL骨髓侵犯的靈敏度、特異度均低于流式細(xì)胞術(shù)，表明骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)在診斷NHL侵犯骨髓方面存在很大局限性，尤其對骨髓中瘤細(xì)胞比例較低及形態(tài)輕度改變的類型，容易漏診。另外，淋巴細(xì)胞反應(yīng)性增生比例較高時容易誤診為淋巴瘤骨髓侵犯；而流式細(xì)胞術(shù)可以對骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)漏診和誤診的局限性做出補充，兩種方法聯(lián)合檢測的靈敏度明顯高于單獨檢測，但兩種方法聯(lián)合檢測的特異度低于單獨檢測，ROC曲線下面積顯著高于單獨檢測，表明兩種方法聯(lián)合檢測優(yōu)于單獨檢測。目前，骨髓活組織檢查、骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)檢測NHL侵犯骨髓均為侵入性檢查，且骨髓活組織檢查和流式細(xì)胞術(shù)檢查費用相對較昂貴，對于淋巴瘤細(xì)胞高度異型性的NHL類型患者可選擇簡單快捷的骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)方法；對輕度異型性的NHL類型患者，形態(tài)學(xué)不易識別且可疑的患者可進一步進行流式細(xì)胞術(shù)和骨髓活組織檢查。

骨髓細(xì)胞形態(tài)檢查是評價NHL分期的一種簡單有效的方法，雖然其不能代替骨髓活組織檢查，但對于高度異形的淋巴瘤細(xì)胞很容易識別，可做出提示性的診斷。而流式細(xì)胞術(shù)通過細(xì)胞分化抗原的檢測對骨髓病理形態(tài)學(xué)不確定的結(jié)果進行補充，可客觀準(zhǔn)確地判斷出異常細(xì)胞的表型特征，兩者互相補充，聯(lián)合影像學(xué)檢查(18F-氟代脫氧葡萄糖正電子發(fā)射計算機斷層顯像/CT)可提高NHL骨髓侵犯的陽性檢出率，避免造成漏診及誤診。NHL侵犯骨髓的模式較多，其早期發(fā)現(xiàn)對NHL的治療方案及預(yù)后具有重要意義，未來需進一步研究敏感性和特異性更高的診斷技術(shù)。