VEGF-A和VEGFR-2基因多態性對嬰幼兒血管瘤患病風險的影響

李 蕾，梁 巍，陳 琛，張紅鵬

(1.河北省人民醫院 a.小兒外科,b.病理科，石家莊 050000； 2.邯鄲市第七醫院普外科，河北 邯鄲 056000)

血管瘤是嬰幼兒時期常見的良性腫瘤之一，好發于頭、面、頸、會陰等重要部位，部分患兒病變范圍廣[1-2]。大部分血管瘤病變可隨患兒生長發育自行消退，且病變消退過程對患兒生命健康無危害，但部分大面積血管瘤完全消退后會出現患處皮膚松軟下垂、色素改變、淺表瘢痕等，對患兒及其家長心理產生一定的負面影響，不利于患兒早期的身心健康[3]。血管瘤常出現于患兒出生時或出生后數天至數周，早期出現內皮細胞的迅速惡性增殖，表現為逐漸突出于皮膚表面的紅色斑塊及皮下青紫色包塊，隨著患兒的生長發育可發生自發消退，具有一定的自限性[4]。血管瘤的治療方式多種多樣，在血管瘤藥物治療中，最常用的治療藥物為普萘洛爾，療效較確切，但可出現一定的不良反應，長期服用可出現心率減慢、心律失常、低血壓、低血糖、支氣管痙攣等嚴重并發癥[5]。研究指出，普萘洛爾的規范治療可明顯縮短嬰幼兒血管瘤的自然病程，具有良好的臨床耐受性，住院期間密切觀察患兒病情變化，及時處理并發癥，可顯著改善患兒病情并緩解患兒家長的焦慮情緒[2]。普萘洛爾通過抑制血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達抑制血管瘤內皮細胞的增生，進而減少內皮細胞的遷移和血管增生，誘導內皮細胞凋亡，抑制血管的生成，從而抑制血管瘤的進展[6]。目前，嬰兒血管瘤的發病機制尚未明確，但有研究表明，VEGF/血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)等多種信號轉導途徑與血管瘤的發病機制密切相關[7]。VEGF-A被認為是VEGF家族最重要的因子之一，不僅可生理性的促進血管形成，還在惡性腫瘤等疾病的進展過程中發揮重要作用[7-8]。本研究旨在探討VEGF-A(+405G/C，rs2010963；+936C/T，rs3025039)及VEGFR-2(+1416T/A，rs1870377；-271G/A，rs7667298)的基因多樣性與嬰幼兒血管瘤患病風險的相關性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年12月至2018年12月在河北省人民醫院小兒外科入院治療的58例血管瘤患兒作為觀察組，選取同期58名健康嬰幼兒作為對照組。納入標準：①觀察組血管瘤診斷明確；②入院前未接受其他治療。排除標準：①合并肺炎、氣管炎及哮喘等呼吸系統疾病或合并急性充血性心力衰竭等心血管系統疾病；②并發肝腎功能不全、其他惡性腫瘤等疾病病史；③出生時合并新生兒窒息或新生兒缺血缺氧性腦病；④參與者臨床資料不完整或依從性差。兩組性別、年齡、體重比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。本研究經河北省人民醫院醫學倫理委員會批準，所有受試者家屬均簽署知情同意書。

表1 兩組受試者一般資料比較

對照組：健康嬰幼兒；觀察組：血管瘤患兒；a為χ2值，余為t值

1.2方法 測定VEGF-A和VEGFR-2的基因多樣性，所有受試者在入院時抽取空腹靜脈血10 mL，置于枸櫞酸鈉抗凝管中并在4 ℃冰箱中保存。在血液樣本收集完成的1周內，應用蛋白酶K消化-飽和氯化鈉鹽析法提取受試者外周血白細胞DNA。

采用聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)方法擴增提取DNA，隨后由上海生工生物工程股份有限公司設計并合成引物。具體方法如下：①PCR反應體系：dNTPs 10 mmol/L，上游及下游引物各10 pmol/μL，PCR緩沖液2.4 μL，Taq DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 2.0 μL。應用PCR擴增儀(PT-100型)進行擴增。反應條件：94 ℃預變性3 min，隨后按94 ℃變性30 s，61 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，進行35個循環后，在72 ℃延伸10 min。②PCR產物電泳檢測反應結束后，將產物置于 0.5×TBE電泳液中，在100 V恒壓水平電泳30 min，檢測是否有特異性擴增產物產生。③限制性內切酶片段長度多態性分析：PCR酶切產物加入2%瓊脂糖凝膠加樣孔中，置于0.5×TBE電泳液中，在120 V恒壓水平電泳30 min，隨后取出放置于紫外光凝膠成像系統下觀察帶型，并將PCR產物純化后測序。

2 結 果

2.1兩組VEGF-A +405G/C和VEGF-A +936C/T位點的基因型和等位基因頻率分布比較 觀察組VEGF-A +405G/C、VEGF-A +936C/T的基因型頻率以及G和T等位基因的基因頻率均較對照組高(P<0.05)，見表2。

2.2兩組VEGR2 +1416T/A 和VEGR2 -271G/A位點基因型和等位基因頻率分布比較 觀察組VEGR2 +1416T/A和VEGR2 -271G/A的基因型頻率均較對照組高(P<0.001)；但觀察組T和G等位基因的基因頻率較對照組低(P<0.05)，見表3。

3 討 論

隨著社會的發展和醫療技術的進步，目前嬰幼兒血管瘤的治療方法較多，逐漸多樣化，主要分為非手術治療和手術治療，其中非手術治療包括激光治療、放射性核素及藥物治療等[9-11]。非手術治療作為血管瘤的首選治療方案，對大部分血管瘤患兒有效，但對一部分患兒的治療效果欠佳，往往需要進一步的手術治療消除病灶，增加了患兒和家長的心理壓力以及家庭的經濟負擔[12]。

大量嬰幼兒血管瘤相關研究報道了其發病機制的新發現，但具體分子機制尚不清楚[4,9-10]。VEGF/VEGFR-2信號通路在血管瘤發病機制中發揮重要作用，因此對影響VEGF和VEGFR的相互作用因素及其蛋白質表達水平的研究逐漸成為研究熱點[13]。研究發現，增殖期血管瘤組織VEGF信使RNA的表達水平明顯高于正常組織和消退期血管瘤組織[10]。另有研究發現，血管瘤組織分離培養的內皮細胞的VEGFR和血管生成素受體的表達水平明顯高于正常組織分離的內皮細胞，提示血管瘤組織內VEGF和血管生成素受體的過表達可能是血管瘤的形成機制之一[11]。VEGF-A通過與內皮細胞表達的酪氨酸激酶受體VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(Flk-1/KDR)和VEGFR-3(Flt-4)的特異性結合發揮特定作用，其中VEGFR-2在血管生成和通透性增加過程中的作用最重要[14-15]。研究表明，與消退期相比，增殖期血管瘤患者血清VEGF-A的表達水平明顯更高[16]。體外研究也表明，血管瘤內皮細胞、血管瘤干細胞和血管瘤周細胞中VEGF的表達水平明顯高于正常組織細胞[17]。VEGF基因存在多個位點的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)，位于基因啟動子或調節區域的SNP，可影響轉錄過程，進而影響蛋白表達，導致疾病易感性的個體差異[18]。

本研究中，VEGF-A 的SNP，即+405G/C(在5′非翻譯區)和+936C/T(在3′非翻譯區)，既往研究指出，+405G/C和+936C/T可顯著影響VEGF的表達水平[19]。VEGF表達失調不僅與腫瘤疾病的發病機制密切相關，還與心血管疾病、子宮內膜異位癥等疾病的發病機制密切相關[20-21]。本研究結果顯示，健康兒童VEGF-A +405G/C和VEGF-A +936C/T的基因型頻率為34.5%和29.3%，與Przewratil等[22]關于VEGF-A的+405G和+936C/T SNP位點GC與CT基因型頻率大致相同的研究結論一致。本研究中，觀察組血管瘤患兒的VEGF-A +405G/C、VEGF-A +936C/T、VEGR2 +1416T/A和VEGR2 -271G/A SNP位點基因型和等位基因頻率與對照組兒童比較均存在差異，說明VEGF-A和VEGFR-2的基因多樣性在血管瘤的發生和發展過程中起主要作用，可能與基因的轉錄過程有關，影響靶基因的蛋白表達。

表2 兩組VEGF-A +405G/C和VEGF-A +936C/T位點基因型和等位基因頻率分布比較 [例(%)]

對照組：健康嬰幼兒；觀察組：血管瘤患兒；a為χ2值，余為t值

表3 兩組VEGR2 +1416 T/A和VEGR2 -271 G/A位點基因型和等位基因頻率分布比較 [例(%)]

對照組：健康嬰幼兒；觀察組：血管瘤患兒；a為χ2值，余為t值

通過測定血管瘤患兒外周血清VEGF和VEGFR-2信使RNA的表達水平檢驗基因多態性與細胞因子表達水平相關性研究顯示，+405G/C和+936C/T基因多態性個體血清的VEGF-A信使RNA表達水平明顯高于對照組，且存在+405G/C基因多態性的GG純合子個體的血清VEGF-A信使RNA表達水平最高[23]。

目前，對血管瘤發生和發展中VEGFR-2基因多態性的作用仍存在很大爭議。血管瘤的病理學特點是血管內皮細胞增殖活躍，并伴有血管生成和肥大細胞的廣泛聚集，而VEGFR-2是蛋白酪氨酸激酶家族成員之一，具有蛋白酪氨酸激酶結構域，可與VEGF結合激活相關信號通路，調控細胞的生物學行為[21]。一項橫斷面研究發現，普萘洛爾治療嬰幼兒血管瘤取得了滿意的治療效果，但血管瘤患兒和健康對照組嬰幼兒在治療前和治療后血清VEGFR-2表達水平的變化差異均無統計學意義[24]。研究指出，VEGFR-2過表達對血管瘤內皮細胞磷酸化過程起重要作用[25]；動物實驗研究發現，敲除VEGFR-2基因可明顯抑制大鼠血管瘤內皮細胞的增殖過程[26]。有研究指出，VEGFR-2在血管瘤組織增生期的表達水平明顯高于消退期；與消退期血管瘤組織和正常組織相比，血管瘤組織VEGFR-2基因上游啟動子序列存在異常甲基化，進一步說明VEGFR-2基因的多樣性，且VEGFR-2基因的異常甲基化可能在血管瘤組織發生、增殖及消退過程中發揮重要作用[27]。以上研究均表明，VEGFR-2的高表達及基因多態性在血管瘤發生和發展過程中起重要作用。由于本研究樣本量較少，存在一定的局限性，研究結果可能存在一定偏倚，仍需要多中心大樣本臨床回顧性研究的進一步驗證。

綜上所述，VEGF-A和VEGFR-2的基因多態性與嬰幼兒血管瘤患病風險存在相關性，VEGF-A和VEGFR-2的基因多樣性可能是嬰幼兒血管瘤發病的危險因素之一，通過對血管瘤易感人群的篩選以及疾病預防、早期診斷和早期干預的分子水平研究，有望提高血管瘤的治愈率，從而改善血管瘤患兒的預后。