圍手術期自體血回收分離機制備富血小板血漿和自體凝血酶的研究

鄭少強，張文杰，何錫強，周 雁，趙堯平，王 庚

(北京積水潭醫院麻醉科，北京 100035)

富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)是全血經離心分離后獲得的血小板(platelet，PLT)濃縮物，是自體源性血液制品。PRP含有生理濃度數倍的PLT，因制備方法不同，其可能含有高濃度白細胞(white blood cell，WBC)、生長因子和纖維蛋白原等[1-2]物質。大量研究表明，圍手術期應用PRP有益于患者康復[3-6]。術前采集自體PRP，術中必要時予以回輸，可改善患者凝血功能，減少術中、術后出血及異體用血量[5,7-9]。PRP的激活產物包括富血小板凝膠(platelet-rich gels，PRG)和PRP釋放物或提取物。已有證據表明，局部使用PRG可減少術后引流量，加快切口恢復，促進組織修復，從而改善骨折不愈合、肌肉韌帶損傷、骨性關節炎、難愈創面患者的預后[5-6,10-12]。可見，安全、經濟、有效、可操作性強的PRP及PRG制備方法對PRP能否在臨床廣泛應用十分重要。但市售PRP制備設備存在耗材價格昂貴的問題，不利于臨床推廣使用。而自體血回收分離機設置為分離模式，可將患者全血進行分離制備PRP。本研究旨在驗證圍手術期使用自體血回收分離機制備PRP的可行性及有效性，并探索制備自體凝血酶，及用自體凝血酶激活PRP制備PRG的方法。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年10月至2019年1月在北京積水潭醫院行單側全髖關節置換術的30例患者作為研究對象，按照隨機數字法分為觀察組和對照組，各15例。 納入標準：①年齡>18歲，體重>60 kg，性別不限；②因髖關節骨性關節炎，行單側全髖關節置換術；③美國麻醉醫師協會分級Ⅰ～Ⅲ級；④術前無貧血(血紅蛋白>120 g/L，血細胞比容>35%)，PLT>150×109/L，無PLT功能障礙，凝血功能正常。排除標準：①嚴重肺、心、腎、肝等功能異常，凝血功能異常；②術前高熱及貧血；③不能配合或其他原因不能行全髖關節置換術；④不愿配合或拒絕參加研究。兩組患者的性別、年齡等一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究經北京積水潭醫院倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

表1 兩組行單側全髖關節置換術患者的一般資料比較

對照組：患者在術前30 min使用自體血回收分離機制備PRP，制備成功后，使用10%葡萄糖酸鈣激活PRP；觀察組：患者在術前30 min使用自體血回收分離機制備PRP，制備成功后，將制得的PRP 1.5 mL用于制備自體凝血酶，使用自體凝血酶激活自身PRP以制備PRG；PRP：富血小板血漿；PRG：富血小板凝膠；a為χ2值，余為t值

1.2試驗設備及材料 血液回收分離機(美國血液技術公司，型號：cell saver 5+)、一次性使用血細胞分離器(美國血液技術公司，規格261、244)、電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司，型號：DK-S22)、微型低速離心機(杭州奧盛儀器有限公司，型號：AS-4K-1069)、水平震蕩儀(常州榮華制造有限公司，型號：TY-80B)、EP管、一次性使用無菌注射器[美國BD (Becton,Dickinson and Company)公司，規格2 mL、5 mL、10 mL]、醫用三通(德國貝朗醫療有限公司生產，型號：409511CN)。

1.3試驗方法 所有患者均在術前30 min使用自體血回收分離機制備PRP。制備成功后，觀察組將制得的PRP 1.5 mL用于制備自體凝血酶，使用自體凝血酶激活自身PRP以制備PRG；對照組使用10%葡萄糖酸鈣激活PRP。除激活物不同外，兩組的其他激活條件均相同。患者于手術當天進入手術室后建立無創血壓檢測、脈搏氧飽和度監測、心電圖監護和靜脈通路，輸入乳酸鈉林格液500 mL，Allen試驗陰性后，行橈動脈穿刺置管，連接動脈測壓裝置。采血前取動脈血行血氣分析，測定pH值、動脈血二氧化碳分壓、動脈血氧分壓、血紅蛋白、血細胞比容等。

1.3.1PRP分離 按血液回收分離機操作規程安裝離心杯、分離管路、儲血袋等耗材，使用枸櫞酸鈉注射液預充管路抗凝。主機選擇分離模式，將采血端連接動脈，開始運行，分離出貧血小板血漿、PRP及紅細胞，分別進入相應儲存袋。采血過程中輸注羥乙基淀粉130/0.4氯化鈉注射液300～500 mL，嚴密監測患者生命體征，無創血壓監測選擇連續測壓模式。當患者出現血流動力學明顯變化(血壓、心率變化范圍超過基礎值20%)或有相關不適主訴時，停止采血，并予以記錄。采血完成后，再次取動脈血行血氣分析，測定pH值、動脈血二氧化碳分壓、動脈血氧分壓、血紅蛋白、血細胞比容等，開始麻醉手術。取PRP 2 mL送檢，檢測PLT及WBC含量。將分離出的PRP置于水平震蕩儀振蕩保存，振蕩頻率為60 次/min，振幅5 cm。

1.3.2自體凝血酶制備 參照Franco等[13]制備自體凝血酶的方法，取PRP 1.5 mL與10%葡萄糖酸鈣溶液0.5 mL置入EP管混勻，37 ℃水浴15 min，水浴結束后，900×g離心10 min后，使用注射器接16 G 針頭吸出EP管上層物質，即為自體凝血酶。

1.3.3PRP凝膠制備 觀察組將4 mL PRP與 1 mL 凝血酶分別置入注射器，通過醫用三通勻速推注混勻，噴入容器。對照組使用同樣方法將4 mL PRP與1 mL 10%葡萄糖酸鈣混合。混合結束時開始計時，每隔1分鐘觀察PRP是否聚集成半固體凝膠，若聚集凝集，將容器傾斜至60°，觀察PRP是否流動；若3 min時不聚集，則之后每隔3分鐘觀察1次， 記錄凝集時間。若PRP與激活物混合30 min后仍未聚集，停止觀察，記為未凝集。

1.3.4自體血回輸 依據輸血原則，術中必要時將分離出的貧PLT血漿、紅細胞及剩余PRP回輸。術野回收自體血也根據輸血原則在必要時予以輸注。

2 結 果

所有患者在采血過程中血流動力學無明顯變化，無相關不適主訴，均完成采血及PRP制備。30例患者的平均采血量為(316±34) mL，制備PRP(33±7) mL；與采血前相比，采血后血紅蛋白下降(8.1±1.4) g/L，血細胞比容下降(4.8±0.9)%。兩組患者的PRP生成量、PLT基礎值、PRP中PLT含量及富集度、WBC基礎值、PRP中WBC含量及富集度比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。觀察組將PRP與5%葡萄糖酸鈣混合物水浴離心后制得自體凝血酶(圖1a)，將其與PRP混合后，可發生聚集形成PRG(圖1b)，其中12例2 min時凝集成凝膠，3例3 min時凝集，容器傾斜至60°不流動；對照組PRP與5%葡萄糖酸鈣混合后30 min后均無凝集，容器傾斜至60°液體流動。

3 討 論

PRP是全血經離心分離后獲得，由于全血中紅細胞、WBC、血漿、PLT等血液成分比重不同，故將全血進行離心時，各種血液成分會進行分離，分為紅細胞、貧血小板血漿及PRP，PRP即據此原理制造。隨著PRP在臨床中的廣泛應用，各類商用PRP制備套裝層出不窮。大多數商用套裝機器主體及耗材需分別購買，機器安裝需獨立空間[14]。自體血回收分離機為PRP制備裝置的一種，其同時具備制備PRP和術野自體血回收的功能。對于因預計術中出血量大而使用術野自體血回收的患者，自體血回收分離機僅在血液回收耗材基礎上增加成分血儲存袋，更改主機工作模式即可完成PRP制備。而其他類型設備需單獨設立空間安裝，故自體血回收分離機在圍手術期可一機兩用，節約手術室空間；同時管路共用，可節省成本，減輕患者經濟負擔。目前公認的PRP的“富血小板”標準，需要PRP中的PLT濃度高于生理全血濃度至少4倍才能達到有效治療濃度[15-16]。根據含WBC數量的多少，PRP可分為富白細胞PRP和貧白細胞PRP，其中富白細胞PRP中的WBC可釋放出遞質，誘導多種細胞黏附和聚集，從而具有更好的抗炎作用，更利于組織修復。目前，研究已證實自體血回收分離機制備PRP的效果[7-8]。本研究對自體血回收分離機制備的富白細胞PRP進行檢驗，其PLT和WBC含量均超過全血4倍，滿足后續自體凝血酶及PRG制備所需條件。

組別例數PRP生成量(mL)基礎PLT (×109/L)PPR PLT (×109/L)PLT富集度(倍)基礎WBC(×109/L)PRP WBC(×109/L)WBC富集度(倍)對照組1532.5±4.5203.7±31.4105 5.2±92.15.2±0.56.9±1.232.5±4.55.3±0.9觀察組1533.0±4.2210.9±24.5103 7.7±83.94.9±0.46.6±1.033.3±5.45.0±0.6t值0.2940.7000.5450.6430.5661.0700.748P值0.7710.4900.5900.5420.5760.2940.436

對照組：患者在術前30 min使用自體血回收分離機制備PRP，制備成功后，使用10%葡萄糖酸鈣激活PRP；觀察組：患者在術前30 min使用自體血回收分離機制備PRP，制備成功后，將制得的PRP 1.5 mL用于制備自體凝血酶，使用自體凝血酶激活自身PRP以制備PRG；PRP：富血小板血漿；PRG：富血小板凝膠；PLT：血小板；WBC：白細胞

PRP通過激活PLT，向周圍環境釋放其顆粒內容物，發揮促生長及炎癥抑制作用。PLT被激活后會釋放多種內容物，包括刺激細胞增殖、合成與代謝的生長因子(血小板源性生長因子、轉化生長因子-13、血管內皮生長因子、表皮生長因子等)。同時，PLT還會釋放一些炎癥反應抑制因子，抑制由白細胞介素-1β引起的炎癥反應，使細胞不受炎癥反應的損傷，如γ干擾素、白細胞介素-1受體拮抗劑、可溶性腫瘤壞死因子受體Ⅰ和Ⅱ、白細胞介素-10 、白細胞介素-4和白細胞介素-13等。除上述生長因子及炎癥因子外，PLT還會釋放纖維蛋白原，纖維蛋白原聚合為纖維蛋白，形成具有一定強度和黏附性、肉眼可見的網狀凝膠，即PRG。在聚合過程中，纖維蛋白原參與凝血、收縮創面，為修復細胞增殖提供生物支架，對損傷愈合有促進作用[16-18]。體外應用時PRP必須激活后使用；當作為組織包埋媒介或止血劑時PRP也需要激活。其激活方法有加入氯化鈣或凝血酶，同時加入氯化鈣和凝血酶以及物理方法等，目前最常用的方法為添加牛凝血酶和氯化鈣[5-6,19-20]。但這種方法制備的PRG存在一定風險：牛凝血酶的添加會導致凝血因子Ⅴ、Ⅺ抗體形成，并有發生嚴重凝血紊亂的可能性，甚至會威脅生命[21-22]。目前，國內動物來源凝血酶成品價格較高，其用于人體有過敏、排異等風險，且用于關節腔內或深部組織注射的安全性尚未完全證實。有文獻報道，可使用PRP制備自體凝血酶[13]。本研究在PRP中加入5%葡萄糖酸鈣經水浴、離心制得自體凝血酶，并進一步成功將PRP激活形成凝膠，證實了自體凝血酶制備及激活PRP的可行性。使用自體凝血酶激活PRP，不僅避免了過敏與排異的可能，免除異種生物制劑進入關節腔的風險，還可降低醫療成本。

未激活PRP呈液態，其局部用于創面或手術切口內，會在重力作用下流向最低位置，與創面接觸時間短，無法充分發揮作用。PRP與激活劑混合后，凝集為PRG，流動性降低，附著于創面，延長作用時間。而激活劑與PRP混合后短時間內凝集形成PRG，可保證PRG與創面的作用時間。若激活劑作用于PRP形成PRG所需時間過長，則PRP可能在未形成PRG時即因重力作用離開創面，無法保證PRG有效成分充分發揮作用。本研究在激活劑與PRP混合觀察30 min后即停止，其不足之處為5%葡萄糖酸鈣可能在超過30 min后激活PRP形成PRG而未被觀察到，但即使可激活，其臨床應用意義不大。

綜上所述，圍手術期利用自體血回收分離機制備自體PRP具有可行性，PRP中的PLT可達到治療水平。同時，使用PRP水浴離心制備自體凝血酶，進一步激活制備PRG方法可行，且簡便經濟。