提高乳酸菌耐膽鹽能力的研究

王保根，龐泳，陳思貝

（黃淮學院生物與食品工程學院，河南駐馬店 463000）

乳酸菌作為一種優良的益生元，在食品、養殖、保健和醫藥等方面得到了極大的推廣和應用，尤其是在腸道微生物健康成為人們關注熱點的今天，益生菌的開發成為熱點研究內容[1]。乳酸菌想要發揮其益生作用，就必須定植于人體內環境[2]。這就要求乳酸菌能抵抗胃的強酸環境以及膽鹽的毒性作用[3]。乳酸菌自身產乳酸，對于酸性環境有一定的抗性；而對于含有膽鹽的環境，不同的乳酸菌表現出不同的抗性。可以確定的是，乳酸菌具有較強的耐膽鹽能力，才能更好地在腸道發揮其益生作用[4]。

耐膽鹽能力是篩選乳酸菌的重要標準之一，目前對于乳酸菌耐膽鹽能力的研究已有諸多報道，但是對于乳酸菌耐膽鹽的機制尚不完全清楚[5]。通過人為來提高乳酸菌耐膽鹽的能力，不僅可以更好地利用這些生物資源，也能幫助人們探究乳酸菌耐膽鹽的機制，以更好地發揮乳酸菌作為益生菌的作用，為人類的生產生活帶來福音。

1 乳酸菌的耐膽鹽機制

目前，人們對于乳酸菌耐膽鹽的機制了解得還不全面，通過篩選具有較強耐膽鹽能力的優良乳酸菌，可以對耐膽鹽機制有一定的初步了解。目前的研究中，認為乳酸菌的耐膽鹽機制大致可以分為3類：膽鹽水解酶的作用、細胞的自我保護作用以及相關蛋白質的表達。

膽鹽水解酶是一類廣泛存在于哺乳動物腸道微生物中的胞內酶，由BSH基因編碼。乳酸菌作為腸道微生物的優勢菌群之一，本身可表達膽鹽水解酶，進行膽鹽修飾，將膽鹽水解成游離的膽汁酸和氨基酸，以此來抵御膽鹽對自身的毒性作用[6-9]。

從抑菌的機制來看，膽鹽能夠與細胞膜上的脂肪酸相互作用，改變了細胞膜的物理及化學性質，使細胞膜的結構和組成發生變化，從而使菌體破裂死亡[10-12]。乳酸菌在含有膽鹽的環境中會發生一系列的應激反應，為維持細胞膜的正常生理功能，細胞膜的脂肪酸會發生變化，細胞膜表面蛋白的表達同樣發生變化；同時乳酸菌也會利用小分子糖類物質，產生的ATP通過H+-ATP酶排出質子來調控細胞內pH值的動態平衡，以防止細胞酸化，保護乳酸菌在膽鹽環境中的正常形態。

膽鹽脅迫會使蛋白質折疊或變形，烏日娜[13]、安浩然[14]在含有膽鹽的環境中培養乳酸菌并分析其蛋白質組的變化，發現多種蛋白質的表達發生了變化，推測其中多種蛋白質在乳酸菌耐膽鹽方面發揮了重要作用。

2 提高乳酸菌株耐膽鹽能力的措施

2.1 馴化培養

Chou等[15]研究發現，用膽鹽選擇性馴化乳桿菌的膽鹽耐受性是有效的，經過幾代膽鹽馴化后得到的乳桿菌，耐膽鹽能力比親代乳桿菌強。通過馴化，使乳酸菌長期生活在最佳生存范圍偏一側的環境條件下，久而久之就會導致乳酸菌耐受曲線的位置移動。張穎[16]對分離自乳液及乳制品中的27株植物乳桿菌進行膽鹽馴化培養，最終得到了具有較強耐膽鹽能力的植物乳桿菌。

研究發現，對乳酸菌進行耐膽鹽馴化培養是可行的，同時對乳酸菌進行其他方面的馴化培養也有類似的效果。宋照軍等[17]通過耐硒篩選，確定嗜熱鏈球菌為耐硒菌種，以濃度梯度法對其進行馴化，最終得到富硒菌種；馬新新[18]從內蒙古傳統酸菜汁中分離到32株乳酸菌，測定了其在不同糖濃度的MRS改良液體培養基中的生長狀況，篩選出了兩株耐高糖乳酸菌S5-1和S6-3，對其進行耐高糖馴化，使兩株菌的耐糖能力分別提高至55%和50%；趙戎蓉[19]通過溫度梯度法對乳酸菌株進行馴化，成功獲得耐60 ℃高溫的乳酸菌 ATCC 4356。

2.2 利用外源物質

益生菌除自身具有一定的耐膽鹽能力外,與其同時使用的食物載體原料也會影響益生菌活性[20-21]。研究發現，一些谷物的提取物能明顯增強乳酸菌耐膽鹽的能力。

曾東等[22]將乳酸菌培養在含有玉米、豆粕、麥麩提取物以及1%膽鹽的培養基中，發現乳酸菌的耐膽鹽能力明顯增強；靳志強等[23]將小米提取物添加到含有膽鹽的培養基中，發現乳酸菌對膽鹽的抗性明顯提高。

他們推測，乳酸菌能夠利用這些外源物質中的糖類物質產生ATP，通過H+-ATP酶排出質子來調控細胞內pH值的動態平衡，來防止細胞酸化。盡管不同的菌種在這些食物的提取液中，對膽鹽的抗性是有差別的，但可以肯定的是，對膽鹽的耐受性都有了一定程度的提高。

Kimoto等[24]將六株乳球菌接種在含有吐溫-80的肉湯培養基中培養，發現其對抗膽汁的能力增強。實驗中發現，在含有吐溫-80的肉湯培養基中，乳球菌細胞膜的脂肪酸組成模式存在差異：在含有吐溫-80的環境中生長的乳球菌，十六烷基脂肪酸和環丙烷脂肪酸明顯降低，而十八碳烯酸含量明顯增加。

雖然目前尚不清楚在對抗膽汁中起關鍵作用的脂肪酸的種類，但是可以肯定的是，吐溫-80等非離子洗滌劑在一定程度上可以改變細菌脂肪酸的分布模式，從而使細胞膜的疏水性增強、通透性降低，以此來維持細胞的穩定，提高對膽汁的耐受力，Boever[25]、Conway[26]等也有類似的發現。

2.3 分泌膽鹽水解酶（BSH）

膽鹽水解酶對結合型膽鹽的解離可以被看作一種解毒機制[27]，在乳酸菌消除膽鹽對其自身影響的各種機制中，攜有膽鹽水解酶（BSH）活性被認為是乳酸菌為了適應腸道中的膽汁環境而進化出的一種應對策略[28-29]。有研究表明，菌體分泌的膽鹽水解酶活力越髙，其在膽鹽環境中的存活率越高[30-31]。

膽鹽是由膽汁酸與牛磺酸、甘氨酸結合形成的鈉鹽或鉀鹽，即牛磺酸結合膽鹽和甘氨酸結合膽鹽。膽鹽水解酶能夠水解這種結合型膽鹽，使膽酸和氨基酸鏈接的酰胺鍵打開，生成游離的膽汁酸和氨基酸。盡管目前仍不清楚膽鹽水解酶特異性識別膽鹽的具體部分，但無論是膽酸部分還是氨基酸，最終都是將其水解成對菌體影響較小的非結合型膽鹽。

結合型膽鹽會引起細菌表面疏水性及表面電勢等表面特征的變化，使得細胞膜通透性和流動性發生變化，鑲嵌在膜里面的酶系統發生紊亂，與之對應的功能不能正常運轉。高濃度的結合型膽鹽甚至能夠直接溶解細胞膜中的脂質，造成膜蛋白分離，使細胞死亡[32]。從這點來說，被水解后的非結合型膽鹽，膽酸部分雖然依舊可以通過反轉擴散至細胞中對菌體造成毒性，但本身由于是弱酸，比結合型膽鹽對細菌本身造成的毒害要少很多。

隨著對膽鹽水解酶研究的加深，人們逐漸認識到應該將具有高膽鹽水解酶活性作為優良乳酸菌的篩選標準。畢潔等[33]通過基因工程將兩個外源性膽鹽水解酶表達在乳酸乳球菌中，發現其對膽鹽的抗性大大增強。

當然，膽鹽水解酶作為一種活性酶，其表達量越多，生成的膽酸也就越多。膽酸對于細菌本身是不利的，提高膽鹽水解酶的底物專一性、減少對細菌有害膽酸的生成，依舊是今后研究的一大方向。

2.4 包埋

腸道中食物的存在也影響著乳酸菌在腸道中的存活率。Hou等人[34]建立了一種乳酸菌保護技術，將細菌細胞包裹在人工芝麻油乳劑中，以對抗模擬胃腸道環境。這種純化芝麻油是由99%的石油、0.5%的磷脂、0.5%的蛋白質在70 ℃加熱1 h后生成的。將脫脂乳培養的細菌包埋在芝麻油以及植物油組成的人工油乳劑中，發現在4～6℃環境下被包埋16 d的乳酸菌與未包埋相比存活率顯著上升（從0.023%到5.450%）。結果表明，人工芝麻油乳狀液可作為一種包封乳酸菌的生物膠囊。

3 結語

乳酸菌耐膽鹽機制是一個極其復雜的過程，從基因的表達到外源物質的利用，乳酸菌通過一系列的手段來應對膽鹽脅迫，以此來提高菌體本身對膽鹽的耐受性。

目前，市場上已經存在很多乳酸菌益生產品，如酸奶、乳酸菌活菌膠囊等。雖然廠家標注了活菌數，但有學者檢測過這些乳酸菌產品的活菌數，很多產品都是遠小于廠家標出的數值。即使活菌數達到廠家所標注的數量，但每個人的腸胃環境又有著諸多區別，乳酸菌到達腸胃能否能發揮其益生作用還有待考究。

隨著益生菌在疾病治療方面的發展和對益生菌越來越高的要求，破解乳酸菌的耐膽鹽機制十分重要。探究乳酸菌耐膽鹽能力提高的過程事實上也是進一步探索乳酸菌耐膽鹽機制的過程。隨著蛋白質組學、基因組學、代謝組學的發展，研究者們將有更多的辦法來探究乳酸菌在腸道環境中一系列生理變化。相信在不久的將來，人們能夠更好地利用這些生物資源，充分發揮益生菌的益生作用，為人類造福。