兩種檢測嗜肺軍團菌方法的對比

付喜梅，黃慶華，俞秋華

（四川省疾病預防控制中心，四川成都 610041）

軍團菌是一種可以引起急性細菌性呼吸道疾病（軍團菌病）的細菌，且90%以上的軍團菌病是因為感染嗜肺軍團菌所致（Legionella pneumophila，Lp）[1]。嗜肺軍團菌是革蘭氏陰性菌，廣泛存在于自然水體、人工水系統、空調冷卻系統及沐浴用水中，可通過氣溶膠的方式傳播給人體[2]。目前，中央空調在公共場所中使用廣泛，人工噴泉往往也在人口密集的場所，這些因素都會增加嗜肺軍團菌的感染。因嗜肺軍團菌生長周期長，營養要求嚴格，傳統的細菌分離培養方法操作繁雜、陽性檢出率較低，不利于公共環境的衛生監測，同時也不便于在臨床普及應用[3]。因此，主要針對集中空調冷凝水中分離出的血清1型噬肺軍團菌進行稀釋培養和Legiolert定量盤檢測。

1 材料與方法

1.1 試劑

GVPC選擇培養基（北京陸橋），BCYE軍團菌基礎培養基（北京陸橋），軍團菌診斷血清，Legiolert配套試劑，Legiolert定量盤。

1.2 儀器

371型 CO2恒 溫 培 養 箱，Thermo ELECTRON CORPORATION；16824 型過濾器，Sartorius Biotech；DL30 型 水 浴 鍋，Thermo SCIENTIFIC； Quant-Tray sealer plus型 Legiolert定量儀，IDEXX。

1.3 實驗方法

本研究在2017年和2019年共采集冷卻水樣12份，依據WS394-2012《公共場所集中空調通風系統衛生規范》處理樣品，將500 mL水樣無菌操作進行過濾，取下濾膜并將其置于15 mL滅菌水中，充分洗脫，處理后進行接種培養及分離鑒定。隨后取陽性菌株嗜肺軍團菌血清1型用無菌水進行適當稀釋，選擇適宜稀釋度懸液接種，吸取0.1 mL稀釋液接種于GVPC平皿上并均勻涂布，做活菌培養計數，然后將培養皿放入 37 ℃的CO2培養箱培養7 d。Legiolert定量盤檢測方法如下：取上述稀釋度的懸液1 mL至含100 mL無菌水的不含硫代硫酸鈉的無菌取樣瓶中，后加入配套Legiolert試劑，蓋上瓶蓋，搖勻至試劑完全溶解。將處理好的樣品全部倒入Legiolert定量盤中，輕拍或輕彈定量盤，以排出空氣，然后立即放入Quanti-tray PLUS程控定量封口機中封口，取出定量盤并將紙板面向下于（37±0.5）℃培養箱培養7 d，同時設置陰性對照來判讀結果，培養時需在培養箱底部放入托盤，內置一定體積的水，保證80%的濕度。

2 結果與分析

采集的12份冷卻水中共檢出嗜肺軍團菌陽性2份，其中嗜肺軍團菌血清1型1份，嗜肺軍團菌2-15型1份。

分別取嗜肺軍團菌稀釋濃度為1∶107、1∶108、1∶109、1∶1010的稀釋液0.1 mL接種在GVPC平皿上，在CO2培養箱培養第7 d的菌落計數結果分別為247 CFU、12 CFU、2 CFU、0 CFU。Legiolert定 量 盤檢測方法培養不足7 d出現的陽性反應可以確定嗜肺軍團菌檢出，但準確的定量結果需要在第7 d讀取。分別取嗜肺軍團菌稀釋濃度1∶107、1∶108、1 ∶ 109、1 ∶ 1010的稀釋液 1 mL至100 mL的Legiolert試劑瓶中，封口后的定量盤培養第7 d時計數，稀釋濃度分別為 1∶107、1∶ 108、1∶109、1∶1010，計數后查表檢測濃度為 1 109 MPN、98.9 MPN、18.7 MPN、3.9 MPN。

3 討論與結論

隨著社會進步和公共設施的進一步完善，公共衛生檢測工作應當引起更高的重視。在醫院、酒店、地鐵站等集中空調冷卻塔水以及機場管道水、沐浴用水、景觀水等公共場所均能分離出軍團菌[4-8]。在這些水體系統中，冷卻水中軍團菌檢出率相對較高[6,9-11]，嗜肺軍團菌冷卻塔的溫度不僅適宜軍團菌生長繁殖，且在系統循環過程中會形成氣溶膠造成周圍環境污染。軍團菌在空氣中以氣溶膠的方式經呼吸道傳播，引起軍團菌肺炎或龐蒂亞克熱[12]。因空調通風系統消毒不及時、使用維護不合理等原因，被軍團菌污染的空調通風系統是造成室內空氣污染和人員感染的主要來源。軍團菌適宜生長溫度是36～42 ℃，每年的夏秋季節隨著氣溫升高，公共場所的空調使用也較頻繁，冷卻塔的水溫會隨之升高，這有利于軍團菌的生長和繁殖，此時間段檢測準確性較高。本研究在調查年份的6—9月采樣，共抽取12家集中空調的冷卻水，檢出出2份嗜肺軍團菌陽性，說明冷卻塔水適宜嗜肺軍團菌生長，需注意冷卻塔水有引發軍團病的危險，本次調查結果與多個空調冷卻水、冷凝水軍團菌污染調查結果一致[13]。軍團菌病的預防主要是切斷空調冷卻水、景觀水等水體系統中軍團菌的污染源，常用的含氯消毒劑能有效殺滅軍團菌但是長期使用對空調設備有損傷，因此有效且易實施的消毒方式對環境中軍團菌的控制起著至關重要的作用。

軍團菌是一種專性需氧的革蘭氏陰性桿菌，其生長需要多種鈣、鎂、錳等元素，營養要求較高，實驗室不易培養。分離培養法和Legiolert定量盤檢測方法均可檢出活菌存在與否，實驗過程均能獲得活菌用于后續研究。分離培養法是軍團菌鑒定的金標準，特異性高達100%，但是該方法敏感性比較低，檢出率為25%～75%，受實驗室人員技術影響較大，且培養必須在CO2培養箱中進行[12-13]。Legiolert定量盤檢測方法是基于酶底物反映的原理，通過與陰性對照組對比顏色和濁度的差異判斷結果，7 d內實驗組出現任何顯褐色的跡象或者濁度大于陰性對照，均表明嗜肺軍團菌陽性，即嗜肺軍團菌檢出。濁度大于陰性對照說明有嗜肺軍團菌生長，但其中的指示劑還未顯示出來。7 d內實驗組出現陽性說明嗜肺軍團菌檢出，但定量結果需要在第7 d讀取。Legiolert定量盤檢測方法操作時間短，實驗人員暴露風險降低，受實驗人員技術影響較少，實驗人員的日檢測數量可以大幅度提高，無需二氧化碳培養箱，常規的培養箱即可達到培養條件。本研究中Legiolert定量盤檢測方法初步實驗結果中嗜肺軍團菌檢出范圍為 3.9～2 272.6 MPN/100 mL，其中全部顯褐色的檢出結果為大于 2 272.6 MPN/100 mL，檢測范圍較大，適宜于采樣液體量大但嗜肺軍團菌含量低的樣本，增加檢測敏感性，提高檢出率。該方法適用于生活飲用水和非飲用水中噬肺軍團菌的檢測，若用于冷卻塔水檢測時該方法在第7 d可以計數查表得到定量結果。對于嗜肺軍團菌檢出的場所，定量檢測可以對消毒效果進行監測，指導公共場所衛生消毒工作。