液體活檢在胰腺癌中的研究進展

田宏 金鍔 郭曉鐘 李宏宇

1沈陽市第四人民醫院腫瘤內科，沈陽 110030；2北部戰區總醫院消化內科，沈陽 110016

【提要】 液體活檢作為一種新興技術，主要對循環腫瘤細胞(CTC)、循環腫瘤DNA(ctDNA)及腫瘤來源的外泌體進行檢測，具有操作簡便、快速、非侵入性、重復性強等優勢，在腫瘤的早期診斷、治療、進展與轉移等領域發揮重要作用。本文分析液體活檢技術的優勢和局限性以及臨床應用潛力和發展狀況，對該技術在胰腺癌診斷、預測和治療方面研究進展進行綜述。

胰腺癌的腫瘤相關纖維細胞構成的復雜微環境阻礙了藥物的傳遞，也造成了復雜的信號轉導環境，并通過分泌各種細胞因子影響其生物學行為[1]。盡管CT、MRI和超聲檢查等成像技術能夠為胰腺癌的診斷提供依據，但無法在早期癌癥篩查中提供有價值的信息。糖類抗原19-9(CA19-9)和癌胚抗原(CEA)等常用蛋白質生物標志物在早期胰腺癌診斷中也沒有足夠的靈敏度和特異度，甚至可能產生假陽性結果。傳統的組織活檢雖然可以提供有價值的信息，但胰腺組織取樣困難、有創，無法重復活檢，不適合捕捉腫瘤的整個異質性，不適合分析轉移性病變等[2]，這大大限制了實時監測和應用個性化藥物的機會。為增加胰腺癌患者的存活率并降低患者負擔，采用一種精準、微創和經濟有效的手段進行早期診斷、預后分層和腫瘤監測顯得至關重要。液體活檢是通過檢測人體各種體液中的腫瘤相關生物標志物獲取疾病相關信息的技術，可以幫助監測疾病進展和治療反應，并能夠預測患者的結局。1994年循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)應用于胰腺癌患者檢測[3]，1996年循環腫瘤細胞(circulating tumor cell, CTC)分析應用于胰腺癌患者檢測[4]，2014年外泌體分析應用于胰腺癌患者檢測[5]，使胰腺癌液體活檢分析取得了巨大進步。數字聚合酶鏈反應和下一代測序等新的分析方法的建立進一步加速了液體活檢領域的發展，使胰腺癌基因突變(包括k-Ras、cdkn 2a、tp 53和smad 4)的精確識別和定量成為可能[6]。同時微流體技術的發展及其在生物醫學研究中的最新應用也在液體活檢的進展中發揮重要作用[7]。

一、液體活檢的體液樣本

血液是進行液體活檢的最常見的體液，包括全血、血漿或血清。從血液中取樣是一種簡單易行且微創的方法，可用于檢測釋放進入血液的腫瘤源性成分，但血液中也含有非腫瘤特異性的其他成分，因此采用濾膜法和密度梯度離心法等物理技術或免疫捕獲法和微流控芯片等生物技術進行樣品富集是非常必要的。富集后樣本可以采用測序或染色等方法做進一步檢測，能夠顯著提高檢測靈敏度。

胰腺外分泌腺分泌的胰液由于富含腫瘤來源的成分，可用于檢測胰腺癌[8]。采用經內鏡行腔內引流術或內鏡下膽管內引流術的方法從胰液和膽汁中取樣，通過濃縮腫瘤源性成分濃度可提高液體活檢的靈敏度[9]。由于胰液進入膽管，隨后進入十二指腸和大腸，因此糞便也可以成為液體活檢的樣本來源，但此方面的研究較少，可能是由于該方法的準確性較低。其他體液如唾液、尿液和胸腔積液也可作為檢測胰腺癌的生物標志物的樣本來源，且多種來源的樣本分析能夠提供相互補充的信息[6]。

二、液體活檢的腫瘤衍生成分

目前應用于液體活檢的腫瘤衍生成分主要是ctDNA、CTC和外泌體，這也是胰腺癌最常見的生物標志物。

1．ctDNA：循環無細胞DNA(circulating free DNA, cfDNA)是指細胞凋亡和壞死過程中釋放到循環系統中的，或通過細胞直接分泌釋放到循環系統中的DNA[5]。ctDNA是腫瘤微環境中的腫瘤細胞凋亡和壞死過程中釋放的DNA，也可能是CTC釋放的DNA，是腫瘤液體活檢極具價值的生物標志物。一般意義上提到的cfDNA包括了正常細胞釋放的DNA和ctDNA。腫瘤患者體液中的cfDNA含量一般明顯高于健康人，但一些非惡性狀況下(例如炎癥)的cfDNA也會顯著增加，因此需要進行鑒別判斷。腫瘤患者cfDNA中ctDNA的占比在個體間具有高度的差異性，這可能反映了腫瘤分期和腫瘤大小的差異。大多數腫瘤細胞釋放的ctDNA能夠提供多個基因靶點進行直接測定， 可以對腫瘤的基因突變情況進行全面的分析[8]。ctDNA在體液中的半衰期很短(一般幾個小時)[6]， 一旦釋放到體液中，會被各種機制迅速清除，包括核酸酶作用、腎臟攝取、肝臟和脾臟以及巨噬細胞的降解等。因此針對ctDNA的液體活檢具有很大的挑戰性，檢測的結果僅代表腫瘤的當前狀態，需要進行動態的實時監測。

ctDNA在胰腺癌晚期診斷中是一種很有前景的生物標志物，CTC和CA19-9分析能更好地預測晚期胰腺癌患者的預后生存[10]。高水平的ctDNA與胰腺癌患者的生存率下降顯著相關[11]，也與化療后或化療期間胰腺癌的進展風險增加和手術后復發風險增加密切相關[12-13]。但ctDNA分析并不能很好地用于檢測早期胰腺癌，主要是由于早期(Ⅰ期、Ⅱ期)胰腺癌ctDNA豐度較低，患者血漿中檢測到的ctDNA不超過 30%[14]，而CA19-9對比ctDNA在早期胰腺癌檢測中更優[15]。因此未來改進液體活檢技術將有助于ctDNA在早期胰腺癌的診斷應用。

采用ctDNA的動態監測還能夠評估胰腺癌的進展情況，實時做出治療決策，并提供患者反應的動態視圖，也可以盡早區分疾病穩定和疾病進展來進行相應的治療[16]。同時高水平的ctDNA可能是轉移性疾病的一個重要指標[17]，能夠為術前提供有價值的信息。因此，基于ctDNA的液體活檢能夠為進展性胰腺癌提供關于新突變、腫瘤進展和遠處轉移的多種信息。

2．CTC：腫瘤病變的部分細胞可能會穿透基底膜、基質和血管壁進入體內循環形成CTC。CTC是液體活檢的另一個生物標志物，它們的存在表明了腫瘤的惡性轉移過程。胰腺癌中的CTC群體高度異質化，可以表達上皮、間充質和干細胞標志物以及細胞外基質(ECM)蛋白，同時在CTC中檢測到的突變與原發腫瘤和轉移淋巴結的突變也密切相關[18]。雖然胰腺癌能夠調控免疫監視來保證腫瘤細胞的生存，但由于細胞自身凋亡、剪切流和免疫細胞攻擊，血流中存活的CTC仍然很少[19]。同時血小板也可能通過觸發上皮細胞間質轉化(EMT)和保護CTC免受剪切力的影響而有助于胰腺癌中CTC的釋放和存活[20]。

胰腺癌的CTC液體活檢與胰腺癌的診斷具有顯著的臨床相關性。CTC在早期胰腺癌患者中具有高度敏感性，在Ⅰ期、Ⅱ期胰腺癌患者中其靈敏度高達70%[21]。CTC的存在與預后也密切相關，能夠有效預測生存。薈萃分析顯示，與CTC陰性患者相比，CTC陽性胰腺癌患者無進展生存期和總生存期更短[22]。CTC還可用于預測胰腺癌的腫瘤復發率，血液中CTC數量更多的患者術后復發時間明顯縮短[23]。門靜脈血中CTC的豐度也是術后肝轉移的重要預測因子[24]。循環血液中CTC的豐度是胰腺癌發展階段的代表性指標，它在胰腺癌晚期會顯著增加[18,23]，因此CTC可用于區分轉移性和非轉移性疾病，并能提供手術切除成功與否的預測信息[23]。CT掃描結果進一步證實了CTC豐度與腫瘤大小的相關性[25]。CTC還可用于監測胰腺癌患者對化療和手術的反應和療效[21]。

3．外泌體：外泌體是所有類型的細胞分泌到細胞外的囊泡，包含可能與胰腺癌生長、侵襲和轉移有關的蛋白質組學和基因組學的“運載物”。它們通過攜帶蛋白質、脂類和核酸，在細胞間的信息傳遞過程中發揮重要作用[5]。在胰腺癌的腫瘤微環境中，外泌體能夠產生化療耐藥性的旁分泌信號[26]，也能幫助癌細胞與其他類型的細胞(包括腫瘤相關成纖維細胞、胰腺星形細胞、β細胞)之間進行信息交換。

腫瘤釋放的外泌體還能用于改變生物學功能，如抑制免疫反應、促進脂肪溶解和新發糖尿病，為胰腺癌細胞提供有利的轉移前壁龕等。特異性外泌體通過黏附和觸發一系列信號通路及炎癥反應，與基質細胞和ECM相互作用來控制轉移。

通過比較不同胰腺細胞系及其釋放的外泌體的mRNA表達的研究證明了不同細胞系和相應外泌體之間具有高度相似性，因此外泌體的分析可以很好地反映其腫瘤細胞來源[27]。外泌體檢測有很多優勢：樣本收集無創或微創，穩定性高，能夠攜帶高分子量較長核酸片段，在癌癥的各個階段都可釋放等，這些優勢使外泌體分析成為液體活檢中不可或缺的標志物，也成為當前測序技術檢測全面基因組信息的重要來源[28]。

外泌體膜蛋白GPC1是胰腺癌檢測的精確標志物。Melo等[29]通過檢測外泌體將早期胰腺癌患者從健康對照組和良性疾病患者中區分出來。同樣，Hu等[30]通過外泌體GPC1 mRNA的擴增檢測出早期胰腺癌。靈敏度和特異度>90%。腫瘤源性外泌體是目前已知的利用液體活檢進行早期胰腺癌檢測的最佳標志物之一。GPC1也被證明可以作為胰腺癌的預后標志物，GPC1高表達的患者生存率更低。外泌體還可以反饋腫瘤對手術、化療或放療的反應以及胰腺癌的腫瘤負荷狀況。腫瘤特異性外泌體數量的增加與遠處轉移密切有關[29]。外泌體GPC1 mRNA表達是腫瘤分期的精準生物標志物，能夠顯著區分早期和晚期胰腺癌(P<0.0001)[30]。

三、總結和展望

液體活檢是一種很有前途的技術。ctDNA、CTC和外泌體能夠在不同體液中釋放，為胰腺癌的診治提供重要信息。各種腫瘤源性成分對胰腺癌的診斷、預后和監測具有不同的應用前景。ctDNA可能是晚期胰腺癌生存預測的較好的生物標志物，但在胰腺癌早期診斷中卻不如腫瘤外泌體和CTC更有用。多種生物標志物的聯合應用將擴大液體活檢的臨床應用范圍。

隨著芯片技術的發展，基于芯片的液體活檢也越來越引起人們的關注[31]，這種液體活檢具有樣品消耗低、精確度高、工作流程簡單、靈活性高以及處理時間快和成本低等優勢。不斷發展的微流體平臺可以將整個液體活檢的多步驟流程集成到一個芯片中完成。智能手機的不斷發展，也可以使微流體、生物傳感器或光學傳感模式與智能手機相結合，建立一個方便快捷的液體活檢的平臺，成為胰腺癌診斷、監測和治療評估的重要工具。未來人工智能的不斷發展，液體活檢數據的不斷豐富，也為臨床數據解讀提供了更多更準確的幫助。

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