二甲雙胍對間充質干細胞促成骨作用的研究進展*

鐘夢伊 李 瀟

骨折在人們日常生活中常常發生，特別是在人口老齡化的國家中，對骨折的發生及治療所帶來的問題日益突出。骨折風險的提高與各種代謝疾病有關，例如糖尿病、肥胖癥和骨質疏松癥等[1]。在世界范圍內，2 型糖尿病(T2DM)的發病率正在迅速上升，并已被視為是全球公共衛生突發問題。據國際糖尿病聯合會(IDF)預測，患病人數將會從2015年的4 億1500 萬上升到2040 年的6 億4200 萬[2]。而具體到口腔醫學領域中，糖尿病已被證實為牙周炎的重要促進因素[3]。骨折滿意的預后依賴理想的骨再生修復，牙周炎的治療同樣涉及到骨再生修復。二甲雙胍(metformin，Met)是一種親水性雙胍類藥物，從1998 年以來Lancet 雜志建議作為2 型糖尿病患者的一線藥物而逐漸被廣泛認可[4]。許多研究顯示Met 的應用可降低該類患者發生骨折的風險[5，6]，最近的一項回顧性研究及meta 分析進一步驗證了這一結論[7]。那么這些研究的背后是否提示Met 具有成為良好的促骨修復藥物的潛能？因此，下文將對Met 促進成骨相關研究作一綜述。

1.二甲雙胍與AMPK

Met 是一種帶正電荷的小分子藥物，作為AMPK的一種經典激動劑，其主要通過活化AMPK 而發揮生理作用已得到共識[8]。AMPK 是一種細胞內感受器，其功能包括調控細胞內的能量和物質進出，在骨代謝中有重要作用。研究證明，Met 經細胞膜有機陽離子轉運蛋白(Cell Membrane Organic Cation Transporters，OCT)進入細胞后主要作用于線粒體，通過抑制線粒體呼吸鏈復合物1，從而導致細胞內的磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)/ 三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)比例升高，變構激活AMPK[9，10]。

2.二甲雙胍具有直接促進成骨作用

Met 作為2 型糖尿病患者的一線治療藥物被廣泛應用后，其在降低該類型患者發生骨折的風險方面表現出優秀的潛能[5，6]，在骨再生修復領域備受關注。許多研究認為Met 主要通過激活AMPK 通路來促進成骨樣細胞及MSCs 的成骨向分化；部分學者認為Met 還可磷酸化ERK，刺激e/ iNOS，或抑制GSK3β/ Wnt/ β-catenin 通路，進而促進成骨細胞的成骨分化，這些研究共同表明Met 具有直接的促成骨作用。此外，Met 還可抑制炎癥因子的釋放以及抑制脂肪生成，對骨組織具有保護作用，表明Met 可以間接地促進成骨。

2.1 二甲雙胍經AMPK 信號通路直接促進成骨 骨愈合的過程與動員各種細胞群遷移至骨缺損部位有關，其中間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)具有支持造血、調節炎癥反應、促進組織再生等功能，在修復骨缺損中發揮這關鍵作用[11]。多項細胞及動物實驗先后證實了Met 具有直接促成骨作用，但作用機制眾說紛紜，迄今，較多學者認為Met 主要經AMPK 促成骨細胞及MSCs成骨分化。Molinuevo 等[12]在一系列研究中，證明了Met 可促進前成骨細胞系(小鼠MC3T3-E1 及大鼠UMR-106)和大鼠來源的骨髓祖細胞(bone marrowprogenitor cells，BMPCs)的骨形態發生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)的表達，增加堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性和I 型膠原的生成，表明Met 具有促進細胞增殖、成骨分化的生物學特性，驗證了Cortizo等[13]的實驗現象；在后續的成骨機制探討中，Molinuevo 等[14]證明了Met 經激活AMPK 通路和成骨細胞特異性轉錄因子Runt 相關轉錄因子2/ 核心結合因子1(Runt-Related Transcription Factor 2/ core binding factor a1，Runx2/ Cbfa1)的表達，從而介導BMPCs 成骨分化[5]，并在動物實驗中發現Met 可促進骨缺損修復。

值得注意的是，近年來Agnieszka 等[15]用不同的細胞系進行體外研究時，得到相似促成骨結論。Agnieszka 等[15]發現Met 通過活化大鼠脂肪組織來源的MSCs 的AMPK，促進成骨向分化，其上調AMPK 活性水平與經典AMPK 激動劑AICAR 的作用相似；而在大鼠雙側顱骨缺損模型中，進一步觀察到Met 組的新生骨量和骨體積均顯著高于對照組。Wang 等[15]利用濃度為10μM 的Met 處理與磷酸鈣骨水泥支架(calcium phosphate cement，CPC)共培養的人類誘導多能干細胞衍生的間充質干細胞(induced pluripotent stem cells-derived MSCs，iPSC-MSCs)時，發現可顯著誘導iPSC-MSCs 成骨分化，Agnieszka[15]、Wang 等[16]的機制研究再次提示：Met 是通過激活AMPK 信號通路從而直接促進成骨進程，且Met 的促成骨作用不局限于成骨樣細胞。

具體到口腔醫學，Met 也備受關注，特別是在牙周病治療的領域中。Pradeep 等[17]在牙周治療后患者的牙周袋內局部涂敷Met 凝膠發現，與對照組相比涂敷組的患牙附著喪失最小，探診深度最低，提示Met 具有促進牙周骨組織再生的潛能。Pradeep[18，19]課題組的后續研究結果表明1%Met 凝膠可以顯著誘導慢性牙周炎患者的骨再生。最近，幾位學者的體外研究也顯示了Met 對牙周病治療的潛能，并展現出Met 具有優秀的骨組織工程應用前景。Yang[20]等將Met 聯合聚多巴胺模板化羥基磷灰石支架(Polydopamine-templated hydroxyapatite，tHA)處理人牙周膜干細胞(Human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs)，發現Met 可通過增加磷酸化AMPK 的表達促hPDLSCs 增殖和成骨分化。而Zhao 等[20]利用hPDLSCs 在CPC 支架上的體外種植實驗同樣表明了的Met 優秀的直接促成骨性能。Zhang[22]、Kuang 等[23]的實驗共同表明Met 能顯著上調hPSLSCs 的ALP、骨鈣素、骨橋蛋白、Runx2 等成骨標志物的基因表達水平及蛋白表達，這些研究都提示Met 具有成為牙周組織再生輔助藥物的潛能。

綜上學者的研究可知，這些細胞及臨床實驗都提示了Met 在頜骨缺損修復及牙周組織再生領域方面有著廣闊的研究前景。

2.2 二甲雙胍經其他通路直接促進成骨 盡管許多研究強調AMPK 在成骨分化過程中的重要作用，但是亦有部分學者的研究顯示Met 可經其他通路直接調控細胞成骨。如最初發現Met 對成骨細胞具有直接促成骨作用的Cortizo 等[13]，他們于2006 年研究Met(25～500μM)對兩種成骨樣細胞的影響，首次發現Met 具有直接促成骨細胞分化作用的同時，在機制探索上，認為Met 通過誘導磷酸化ERK 的活化和重分布，并呈劑量依賴性地刺激e/ iNOS 的表達從而促進成骨。此外，Met 還可調控AMPK 和絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine-specific protein kinase，AKT)通路之間的交通。Pantovic 等[24]的研究發現，AKT 和AMPK的活性呈負相關，活化的AMPK 可通過激活AKT/ mTOR 信號通路來促進人骨髓間充質干細胞(Human Bone mesenchymal stem cells，hBMSCs)的成骨分化。Ma 等[25]的研究發現，Met 通過抑制GSK3β/ Wnt/ β-catenin 通路促進hBMSC 的成骨分化。Met 促成骨研究的多樣性表明了其研究前景的廣闊。

3.二甲雙胍間接促進成骨

骨修復是一個復雜且精密的過程，與機體內的其他進程密切相關，包括高胰島素血癥、炎癥產物的沉積以及脂代謝紊亂等在內的過程，都會間接地影響細胞成骨分化及骨缺損的修復[26]。

3.1 抑制炎癥因子的釋放 在骨損傷修復初期，炎性的發生可阻礙細胞的成骨分化及骨組織再生。在炎癥過程中，轉錄因子NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)的磷酸化可減弱成骨細胞的功能，造成細胞損傷和骨基質成熟的延遲；而抑制NF-κB 磷酸化則可增加抗炎因子白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-1β(IL-1β)和白細胞介素-8(IL-8)的釋放[27]。Mai[28]、Son[29]等的研究發現，Met 可通過調節成骨細胞內細胞因子的釋放，促進骨保護素的分泌，并降低NF-κB 的表達，從而抑制破骨細胞的分化途徑，進而間接促進成骨。最近，Mu 等[30]發現Met 在高糖條件下可促進小鼠前成骨細胞的增殖和分化，并且在體外高糖條件下Met 增加沉默信息調節因子2 同源蛋白6(silent mating type information regulation 2 homolog 6，SIRT6)的 表 達，抑 制NF-κB 的磷酸化，并且下調OCT4，從而促進成骨分化，而該課題組在SIRT6 基因敲除小鼠的動物實驗，進一步驗證了Met 抑炎促成骨的作用。

3.2 調控脂代謝，抑制成脂分化 骨代謝調控除了與干細胞的成骨向分化以及炎癥因子的水平相關以外，其和脂代謝也有著密切的聯系。因為BMSCs 可分化為骨代謝中的成骨細胞和脂代謝中的脂肪細胞，當兩者的平衡被打破時，會導致骨代謝相關疾病[31]。

AMPK 除了在成骨過程中發揮重要作用之外，亦是脂代謝途徑的關鍵酶之一。Luo 等[32]發現Met對骨組織的保護作用與其抑制脂肪生成的作用有關。接著，Wang 等[33]研究發現Met 通過AMPK/Gfi1/ OPN 信號通路，抑制脂肪生成從而刺激MC3T3-E1 細胞成骨分化。近年來，Chava 等[34]的研究表明，Met 可通過穩定Runx2 來抑制糖尿病誘導的骨脂肪生成，并且該研究結果首次表明成骨相關標志物Runx2 是AMPK 和Runx2-s118 磷酸化的新底物，而應激誘導的Runx2 降解程度取決于AMPK 的活性水平。這些的研究表明：Met 可調控脂代謝的活動進程從而間接促進細胞成骨分化。

4.展望

如何修復牙周炎所致的骨缺損，儼然已成為口腔臨床醫學中的一大難題，一直以來缺乏良好的輔助治療藥物。Met 具有良好的生物安全性，價格相對低廉以及降糖效果良好，已經多年被廣泛臨床使用。然而，近年來研究發現它的作用不僅僅局限于降糖，已有的臨床和實驗研究表明Met 具有優秀的促成骨性能，有望成為應用于牙周組織再生、頜骨缺損修復等骨組織工程領域的新型促成骨藥物。盡管越來越多的學者已經關注Met 并取得一定成骨，但對于Met 的臨床應用研究則仍處于起步階段，這意味著Met 在該領域中仍有廣闊的研究前景。隨著國內外研究環境的持續發展、研究內容的不斷深入以及研究技術的更新進步，未來有望完全闡明Met 的具體促成骨機制，使其在骨缺損修復及牙周組織再生領域中得到廣泛應用。