alpha2B腎上腺素受體選擇性化合物作用機制研究

劉麗艷 劉若凡 黃寧 陳軍利

(四川大學華西基礎醫學與法醫學院病理生理學教研室，四川 成都 610041)

α2腎上腺素受體(α2-adrenergic receptor，α2-AR)屬于A類(視紫紅質類)G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)，分為α2A, α2B和α2C三種亞型。α2-AR與去甲腎上腺素、腎上腺素等內源性配體結合，通過激活胞內偶聯的G蛋白(主要是Gi/o，但也偶聯Gs和Gq蛋白)，引起下游信號分子環磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate，cAMP)水平變化，參與細胞反應[1]。不同α2-AR亞型的分布和主要功能不同，α2A-AR占中樞神經系統(Central nerve system，CNS)中的90%，主要分布在前額葉皮質(Prefrontal cortex，PFC)，主要功能是突觸前負反饋抑制去甲腎上腺素釋放、低血壓、鎮痛、鎮靜、抑制癲癇患者癲癇發作[2]；而α2B-AR僅在丘腦有較少的表達。對α2-AR受體亞型具有高度選擇性的配體的缺乏，嚴重限制了α2B-AR藥理學功能的探索[3]。

研究顯示，使用不同長度的連接子偶聯兩個藥效團，可增加配體-受體的親和力和效力[4]。4-氨基喹啉類化合物是由2至12個碳原子的烷烴鏈連接兩個4-氨基喹啉組成的化合物，對α2-AR具有較強的親和力，其中，C7對α2B-AR具有選擇性[5]。然而，C7與α2B-AR作用位點尚不清楚。本文旨在通過計算機輔助藥物設計方法及藥理學手段，探討C7對α2B-AR選擇性的分子機制，為研發α2B-AR選擇性藥物打下結構基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

COS-7細胞株，購自ATCC，培養在含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養基中；胎牛血清購自Hyaline公司；DMEM購自Gebico公司。

1.2 方法

1.2.1α2B-AR同源模型的構建及評價

從Uniprot數據庫中，檢索人α2B-AR氨基酸序列(450個氨基酸，P18089)。在SWISS-MODEL中進行序列對比，搜尋與目標序列相匹配的模板。選擇同源性高、分辨率低、晶體結構完整的受體作為構建同源模型的模板，進行建模。構建好的模型采用ERRAT2和Ramachandran Plot進行評分，最優模型被采用。ERRAT2的可接受范圍是≥50%[6,7]。Ramachandran Plot評分值的可接受范圍>90%[8-10]。

1.2.2α2B-AR同源模型loop環的優化

評分較差的loop環區域，利用MODELLER9.18進行優化，每個步驟生成50～100個模型，同樣采用ERRAT2和Ramachandran Plot進行評分，選擇評分最高進行下一步優化，直至所有評分較差的loop環被優化，最后采用ERRAT2和Ramachandran Plot對模型進行評價。

1.2.3分子對接(CDOCKER)

在Discovery Studio中，選定受體模型，根據模型腔定義口袋，改變結合球的大小至能夠包裹胞外環，選定用于對接的小分子，設置最大命中數為100，設置“Pose Cluster Radius”為0.5，余參數默認，運行CDOCKER。

1.2.4cAMP累積實驗

COS-7細胞以密度2×105·ml-1接種于不透明96孔培養板中，100μl/孔，用Lipo2000轉染含α2B-AR基因的質粒DNA至COS-7細胞中，在37℃含有5%CO2的培養箱內培養48h。加無血清、雙抗的DMEM高糖培養基沖洗細胞。每孔加入20 μl含有1 mM IBMX、30 μM Forskolin和不同濃度梯度(10-10～10-3M)待測藥物的DMEM高糖培養基，置于在37℃含有5%CO2的培養箱中孵育30 min。待培養板靜置至室溫后，使用cAMP- GloTMAssay試劑盒按操作說明處理各孔細胞。最后使用酶標儀在562 nm波長下檢測各孔發光強度，以反映各孔cAMP水平。

2 結果

2.1 α2B-AR同源模型的構建及優化

通過SWISS-MODEL構建α2B-AR亞型的同源模型，利用ERRAT2對同源模型進行評分，通過MODELLER對同源模型的胞內外環錯誤值較高的區域進行優化，并評價優化后的同源模型的質量。結果顯示，ERRAT2和Ramachandran Plot對構建的α2B-AR同源模型評分分別為85.054(圖1A)和94.4%(圖1B)。ERRAT2評分中得分較低的區域，圖中呈黑色的峰值，峰值越高，代表錯誤值越高，對錯誤區域處于loop環的氨基酸進行優化，α2B-AR優化區域位于loop環上145～170，200～215，225～245，300～310，320～330，335～345位氨基酸，每一區域的優化生成20個模型，分別用ERRAT2評分，評分最高的模型再進行下一區域的優化，最后評分最高的模型采用ERRAT2和Ramachandran Plot評分分別為93.867(圖1C)和95.9%(圖1D)，得到的最終模型較優化前評分增高，表明同源模型的質量進一步提高。

圖1 α2B-AR同源模型優化前后的ERRAT2和Ramachandran Plot評分注：A：優化前ERRAT2評分；B：優化前，Ramachandran Plot評分；C：優化后ERRAT2評分；D：優化后，Ramachandran Plot評分。

2.2 α2B-AR同源模型的質量檢測

通過CDDOCKER分子對接，對上述構建并優化的α2B-AR同源模型進行質量檢測。在胺類GPCRs中，位于第Ⅲ跨膜螺旋的氨基酸殘基D3.32高度保守，作用于該類受體正性位點的配基與此氨基酸有成鍵作用，在α2B-AR中D3.32氨基酸對應的是Asp92，據此，我們利用α2-ARs已知的激動劑去甲腎上腺素和拮抗劑酚妥拉明分別與構建的α2B-AR同源模型進行分子對接，來檢驗同源模型的質量。結果顯示，去甲腎上腺素與α2B-AR同源模型的Asp92、Ser176、Tyr391形成離子鍵(圖2A)，酚妥拉明與該受體Asp92、Tyr172形成離子鍵，與Tyr391、Phe412形成π-π鍵(圖2C)。此外，去甲腎上腺素和酚妥拉明均位于α2B-AR的正性結合口袋(圖2B，2D)。去甲腎上腺素和酚妥拉明均能與α2B-AR同源模型Asp92成鍵，表明我們構建的α2B-AR同源模型質量較高，可進行下一步的分子對接實驗。

圖2 去甲腎上腺素、酚妥拉明與α2B-AR同源模型分子對接注：A、B：去甲腎上腺素；C、D：酚妥拉明

2.3.4氨基喹啉類化合物(C7)與α2B-AR同源模型結合位點的預測

為了檢測C7與α2B-AR的相互作用位點，我們通過CDDOCKER將C7與α2B-AR同源模型進行分子對接。C7與α2B-AR同源模型分子對接后產生100個對接模式，從對接模式最集中的簇中，選評分最高的對接模式進行分析。結果顯示，C7與α2B-AR的Glu73形成氫鍵，與Tyr391、Phe408、Phe412形成π-π鍵(圖3A)，以此推測這些位點參與C7與α2B-AR相互作用。此外，與去甲腎上腺素和酚妥拉明不同，C7位于不同于α2B-AR正性位點的胞外段(圖3B)。

圖3 C7與α2B-AR同源模型分子對接注：A：俯視圖；B：正視圖

2.4 C7對表達α2B-AR的COS-7細胞內cAMP水平的影響

去甲腎上腺素在10-10～10-3M濃度范圍內可以刺激COS-7細胞內cAMP增加(縱坐標熒光檢測值越低，細胞產生cAMP量越多)(圖4A)，C7在10-10～10-3M濃度范圍內對COS-7細胞內cAMP水平無顯著影響(圖4B)。

圖4 不同化合物對表達α2B-AR的COS-7細胞內cAMP分子水平的影響注：A：去甲腎上腺素(NA)；B：C7

3 討論

α2-ARs屬于GPCRs的一個分支-胺類受體，分為三個亞型α2A-AR、α2B-AR、α2C-AR，其廣泛分布于全身不同組織，參與調節許多的生理病理過程，因此，α2-ARs激動劑和拮抗劑的潛在治療應用很多[11]。傳統的藥物研發主要靶向于GPCRs內源性配體結合位點即正性結合位點，但其高度結構同源性嚴重阻礙了亞型選擇性配體的研發，也是其產生副作用的主要原因之一。研究顯示，靶向別構結合位點進行受體亞型選擇性化合物的設計是一種有效的方法[12]。別構調節劑與受體的別構調節位點結合后，會使受體分子的構象發生改變，進而使受體的正性結合位點的構象發生改變，從而增強(正向別構調節劑)或減弱(負向別構調節劑)外源性激動劑或內源性神經遞質與受體的親和力和/或效力[13]。

前期研究顯示，C7對α2B-AR具有選擇性。本研究首先通過計算機輔助藥物設計的方法預測了C7與α2B-AR的結合模式和相互作用位點。首先，我們構建了α2B-AR同源模型，并對其進行優化，優化前后采用ERRAT2和Ramachandran Plot進行評分。ERRAT2評分是根據蛋白受體不同原子之間的非鍵合作用并與結構高度精細的蛋白進行對比，其優點是能夠定位模型結構不佳的區域，評分50分以上可接受[7]。Ramachandran Plot可以確定蛋白質模型的立體化學結構的質量和精確度，其評分>90%可接受[10]。優化后ERRAT2錯誤值較高的黑色峰值區域已明顯減少，Ramachandran Plot評分升高，評分均在可接受的范圍內，其質量符合要求。Ramachandran Plot中有18個氨基酸在非允許區，經核對它們不位于存在別構調節位點的受體胞外區，對我們的研究影響不大，但后期我們可以對該模型進行進一步優化，以期獲得更好的實驗結果。

在腎上腺素受體中，其正性結合位點的氨基酸D3.32(Asp)是高度保守的，內源性配體可與此氨基酸成鍵[14]。分子對接結果顯示，α2B-AR的激動劑去甲腎上腺素可與α2B-AR的D3.32(Asp92)，Ser176和Tyr391形成氫鍵，而拮抗劑酚妥拉明與α2B-ARAsp92、Tyr172形成氫鍵，與Tyr391、Phe412形成π-π鍵。以上結果表明，去甲腎上腺素和酚妥拉明均位于α2B-AR的正性結合位點，說明我們構建的α2B-AR同源模型質量較高。C7與α2B-AR的分子對接結果顯示，C7與該受體的Asp92沒有成鍵作用，但是可與受體胞外區域的Glu73形成氫鍵，與Tyr391、Phe408、Phe412形成π-π鍵，說明C7可能是通過一種的新的作用方式，即別構調節作用，與α2B-AR結合，進而影響下游信號。

cAMP累積實驗結果顯示，去甲腎上腺素作為α2-AR的激動劑，可以刺激表達α2B-AR的COS-7細胞內cAMP增加，而C7在10-10～10-3M濃度范圍內對COS-7細胞內cAMP的產生沒有影響。說明，C7本身對α2B-AR沒有激活或者抑制作用，可能會通過對α2B-AR的別構調節作用來影響下游信號的傳導。

本研究首次提出了α2B-AR可能存在的別構調節位點，為將來研發α2B-AR選擇性藥物打下結構基礎。