黃腐酚體外抑制STAT3信號發揮抗肝癌作用

李雨含 王祎

(1. 四川大學華西口腔醫學院；2. 四川大學華西基礎醫學與法醫學院病理生理學教研室，四川 成都 610041)

肝癌是嚴重危害人類生命和健康的常見惡性腫瘤之一，揭示其發病機制，探尋潛在藥物靶點是當今腫瘤治療的主要研究策略[1]。信號轉導及轉錄激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)作為一個轉錄因子，主要調節細胞周期、細胞存活、血管生成以及免疫反應等過程。當STAT3被上游酪氨酸激酶磷酸化后，可形成二聚體，進而轉位入核與其調控的靶基因位點的DNA結合，引起靶基因的轉錄翻譯[2]。目前發現，STAT3的靶基因大多與促增殖、抗凋亡、血管生成、轉移、免疫逃避等腫瘤發生發展過程中的生物學行為密切相關[3]。在正常細胞，STAT3具有短暫活化而后迅速失活的特性，然而研究者發現在70%的人類實體腫瘤中，STAT3處于持續高活性狀態[4]。因此，STAT3是一個極具前景的抗腫瘤藥物靶點。

啤酒花(HumuluslypulusLinn.)是眾所周知的釀酒原料，并作為民間藥物被長期使用。黃腐酚(Xanthohumol，XN)是啤酒花中分離得到一種異戊烯類黃酮化合物。近年來黃腐酚的藥用價值受到廣泛的關注，研究證實黃腐酚具有較強的抗炎和抗腫瘤活性，并能增強放化療導致的乳腺癌細胞凋亡[5, 6]。此外，還有報道稱黃腐酚可通抑制多重耐藥基因(Multidrug resistance 1，MDR1)和表皮生長因子受體(Epithelial growth factor receptor，EGFR)等信號通路介導腫瘤細胞凋亡[6]。然而對黃腐酚對肝癌細胞的殺傷作用及其具體的分子機制尚未見文獻報道。

本研究采用人類肝癌細胞系BEL-7402及SMMC-7721為研究模型，揭示黃腐酚在抗肝癌治療中的潛在價值和作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與細胞

黃腐酚(Xanthohumol，XN)，購自成都普思生物有限公司，以DMSO溶解，配制成100 mM的母液，-20℃保存備用。人肝癌細胞株BEL-7402及SMMC-7721，購自上海吉凱生物有限公司，置于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基中，在含5%CO2的37℃環境中培養。4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)購自Sigma-Aldrich。CCK8試劑盒及ECL化學發光底物，購自碧云天。磷酸化及非磷酸化的STAT3、cyclin D1、Bcl2、GAPDH等抗體，由Signal Antibody提供。HRP-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG，購自Proteintech。PVDF膜，購自Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1細胞活力檢測

BEL-7402和SMMC-7721肝癌細胞，按照5000個/孔的密度接種于96孔板中。孵育過夜后，加入不同濃度的黃腐酚(0-40 μM)繼續分別處理24 h和48 h[7]。隨后，每孔加入10 μL的CCK8試劑，37℃孵育2 h，450 nm處檢測吸光度值。

1.2.2細胞核染色

BEL-7402細胞以黃腐酚處理24 h后，隨后以4%多聚甲醛固定15 min,加入DAPI(0.5 μg·mL-1)置于暗處染色5min。最后于倒置熒光顯微鏡(IX53，Olympus)下觀察細胞核染色情況。當細胞核出現熒光強度升高，染色質固縮，細胞核破碎等情況時，則可視為細胞凋亡。隨機選取3個視野，計算凋亡細胞比率。

1.2.3Western blotting

BEL-7402細胞以黃腐酚處理24 h后，棄去培養基，以PBS洗2次。隨后，加入含有1%蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解15 min。收集細胞裂解液后，12000 g，4 ℃離心5 min，取上清液，加入5×Loading buffer，100 ℃煮沸10 min。接著，將等量的樣品上樣至SDS-PAGE膠，經電泳轉膜至PVDF膜，以5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h。隨后，加入不同的一抗(1：1000)，4 ℃孵育過夜。隨后，回收一抗，以TBST洗3次后，加入二抗(1：5000)室溫孵育1 h。最后，以TBST洗3次后，ECL進行曝光顯影。采用Quantity One軟件對條帶進行定量分析。

1.2.4統計分析

所有的統計分析均以Graphpad Prism 5.0軟件進行，數據以平均值±標準差表示。采用單因素方差分析，當P<0.05時視為有顯著性差異。

2 結果

2.1 黃腐酚對肝癌細胞增殖的影響

如圖1所示，黃腐酚(2～40 μM)分別處理肝癌細胞株BEL-7402及SMMC-7721 2 h-48 h后，細胞活力受到明顯影響，其抑制效率最高可達80%(P<0.01)，并呈現劑量依賴性。

圖1 CCK8法檢測黃腐酚對肝癌細胞增殖的影響注：BEL-7402(A)和SMMC-7721(B)細胞增殖情況。數據以平均值±標準差表示，n=3。與溶媒對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

2.2 黃腐酚對肝癌細胞凋亡的影響

與溶劑對照組相比，黃腐酚(20 μM和40 μM)處理組的細胞核出現熒光強度升高，染色質固縮(箭頭所示)和細胞核破碎(三角形所示)。計數分析結果表明，20 μM和40 μM黃腐酚處理24 h可致40%和70%的BEL-7402細胞凋亡，見圖2。

圖2 黃腐酚對肝癌細胞凋亡的影響注：(A)典型的細胞凋亡圖片，標尺=40 μm。(B)凋亡細胞比(%)。數據以平均值±標準差表示，n=3。與溶媒對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

2.3 免疫印跡檢測黃腐酚對肝癌細胞中STAT3活化的影響

與溶媒對照組相比，黃腐酚(5～20 μM)能明顯抑制肝癌細胞中STAT3的磷酸化(P<0.01)，且呈現一定的劑量依賴性。半定量分析結果表明，10 μM和20 μM黃腐酚處理24 h，對STAT3磷酸化的抑制率約為35%和55%。然而，黃腐酚對STAT3的表達沒有明顯影響，見圖3。

圖3 黃腐酚對肝癌細胞中STAT3活化的影響注：(A)典型的Western blotting電泳圖；(B)半定量分析。數據以平均值±標準差表示，n=3。與溶媒對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

2.4 免疫印跡檢測黃腐酚對肝癌細胞中STAT3靶基因表達的影響

如圖4所示，與溶媒對照組比較，黃腐酚(5～20 μM)能劑量依賴性地抑制BEL-7402細胞中STAT3靶基因Bcl-2和cyclin D1的表達。半定量結果顯示，在20 μM黃腐酚處理的肝癌細胞中，Bcl-2和cyclin D1的表達下調達到了70%和50%(P<0.0001)。

圖4 黃腐酚對肝癌細胞中STAT3靶基因表達的影響注：(A)典型的Western blotting電泳圖；(B)半定量分析。數據以平均值±標準差表示，n=3。與溶媒對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

3 討論

STAT3是包括肝癌在內的多種腫瘤發生發展以及耐藥性闡釋的關鍵調控蛋白，因此通過靶向STAT3為肝癌的治療提供了潛在的可能性。前期，Dokduang等人發現黃腐酚能抑制膽管癌細胞中由白介素6(IL-6)誘導的STAT3活化[8]。然而，黃腐酚對肝癌等癌細胞中組成型活化的STAT3的影響并未涉及。在本研究中，我們發現，黃腐酚能有效抑制肝細胞癌細胞中STAT3的組成性活化。同時，黃腐酚也能有效STAT3的靶基因，從而發揮抑制肝細胞癌細胞生長的作用。我們的結果表明，黃腐酚具有預防和治療肝癌的潛在價值。

除了能夠調節與增殖凋亡相關基因的轉錄翻譯外，STAT3還能上調一系列與免疫抑制相關基因的表達，如環氧化酶2(Cyclooxygenase2，COX2)和程序性死亡配體1(Programmed cell death protein 1 ligand 1，PD-L1)等[9, 10]。同時，有研究表明，黃腐酚能夠有效抑制巨噬細胞中由脂多糖誘導的COX2表達[11]。因此，黃腐酚有可能通過抑制STAT3進而抑制了免疫抑制基因COX2等的表達，從而增強了抗腫瘤免疫反應。黃腐酚這一作用在肝癌的免疫治療領域具有較強的潛在應用價值。

綜上所述，黃腐酚通過抑制STAT3的組成型活化，從而發揮抗肝癌的作用。然而，對于其抑制STAT3活化的具體機制，還需進一步研究。