大鼠脊髓背角神經元TRESK變化對lncRNA表達譜的影響*

王文康 許立新 阮祥才 鄭彬 林濤 應彥璐 李恒昌

雙孔鉀離子通道TRESK 在脊髓背根神經節(jié)廣泛表達，除了維持神經元靜息膜電位及神經遞質的釋放，還介導了脊髓水平神經病理性疼痛的發(fā)生，但具體機制不明確，TRESK 可被谷氨酸激活，但對脊髓神經元的作用不詳[1-2]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是長度大于200 個核苷酸的非編碼RNA，在表觀遺傳、細胞周期和細胞分化等調控中發(fā)揮重要作用[3-4]。本研究觀察谷氨酸對大鼠脊髓神經元TRESK 的效應，通過基因芯片技術，檢測脊髓神經元TRESK 變化對lncRNA 表達譜的影響，探討TRESK 是否通過lncRNA 作用于下游信號通道發(fā)揮生物功能，為闡明脊髓神經元TRESK 在神經病理性疼痛中的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 動物和材料 動物為原代SD 大鼠，體質量180～250 g。主要材料：大鼠脊髓背角神經元（ScienCell，M1580-57）、神經元培養(yǎng)基（ScienCell，1521）、倒置光學顯微鏡（奧林巴斯，CKX41）、細胞恒溫培養(yǎng)箱（賽默飛，HERAcell150i）、lncRNA定量試劑盒（日本Takara 公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠脊髓神經元培養(yǎng) 在無菌解剖液的平皿內分離脊髓，0.25%胰蛋白酶經37 ℃消化并吹打，吸取細胞懸浮液移置培養(yǎng)皿中。過濾及沉淀后加入3 mL 的培養(yǎng)基，稀釋計數(shù)后以5×105個/mL將細胞接種于經多聚賴氨酸處理的1×106個/孔，500 μL/ 孔，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，1 d后更換飼養(yǎng)培養(yǎng)液。4 d 后于培養(yǎng)液內加入阿糖胞苷4 μg/mL，用于抑制非神經細胞增殖，培養(yǎng)7 d后進行實驗。

1.2.2 實驗分組和處理 培養(yǎng)原代大鼠脊髓神經元細胞，接種于培養(yǎng)皿中，采取隨機分組法，將其分為4 組：空白組（不進行任何處理）、谷氨酸（Glu）組（谷氨酸100 μmol/L 處理24 h）、Glu+NC siRNA組（siRNA 空白質粒轉染后同Glu 組方法處理）與Glu+TRESK siRNA 組（TRESK siRNA 轉染后同Glu組方法處理）。各組按照上述方法處理結束后，免疫印跡法和RT-PCR 分別檢測各組神經元的TRESK蛋白和mRNA 表達。

1.2.3 免疫印跡法 裂解細胞，離心后取上清液，用BCA 法測定蛋白濃度。蛋白上樣后電泳完畢，將蛋白轉移到PVDF 膜上（4 ℃、400 mA 恒流條件下120 min），室溫封閉PVDF 膜1 h（含5%脫脂牛奶的TBST 溶液），加抗4 ℃過夜；TBST 洗膜，加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗（1∶5 000），室溫下孵育2 h，TBST 洗膜3 次。采用ECL 試劑進行顯色反應后暗室內曝光顯影。

1.2.4 RT-PCR 檢測 谷氨酸處理24 h 后檢測脊髓神經元TRESK mRNA 表達。脊髓神經元離心勻漿，棄細胞上清液，用PBS 液潤洗細胞，采用Trizol 試劑盒提取總RNA，RNA 逆轉錄獲得cDNA。0.5 μg/μL寡脫氧核苷酸（Oligo dT）1 μL 和總RNA 2.0 μg加入PCR 小管中，補充焦碳酸二乙酯（DEPC）水至9 μL；混勻后離心，70 ℃溫浴10 min 后，立即置于0 ℃冰水混合物中冰浴，使Oligo dT 和模板退火，反應體系為：5×RT 緩沖液4.0 μL，10 mmol三磷酸脫氧核苷。

1.2.5 基因芯片檢測 檢測谷氨酸+TRESK siRNA與谷氨酸+NC siRNA 兩組lncRNA 表達譜變化，從總RNA 中移除rRNA 后，得到mRNA；使用隨機引物方法將每個樣品放大并轉錄成帶熒光的cRNA；使用純化標記的cRNAs，并用NanoDrop ND-1000 檢測濃度和活性。洗滌、固定并掃描雜交芯片。lncRNA譜包含探針原始信號的txt 文件導入到GeneSpring GX v12.1 軟件，標準化后，去除低質量探針，得到lncRNA 表達信息。利用Fold change 進行差異lncRNA 篩選，默認Fold change≥2.0，并根據(jù)lncRNA與蛋白編碼基因在基因組上的相對位置關系。

1.2.6 基因本體（GO）分析及KEGG 通路富集分析 GO 分析是采用Gene Ontology 數(shù)據(jù)庫對差異表達lncRNA 進行功能注釋，統(tǒng)計每個基因功能中存在的基因數(shù)量。KEGG 通路富集分析是基于京都基因與基因組百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫來了解差異表達的lncRNA 富集的生物信號通路。分析后計算每個基因功能中差異基因的富集值，富集值越大，表示該基因功能或信號通路受到實驗影響越大。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（）表示，兩兩比較采用t 檢驗，多組比較采用方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 谷氨酸對TRESK siRNA 轉染大鼠脊髓神經元TRESK 表達情況 與空白組比較，Glu 組和Glu+NC siRNA 組TRESK 蛋白及mRNA 表達均明顯上調（P＜0.05）；與Glu+NC siRNA 組相比，Glu+TRESK siRNA 組脊髓神經元TRESK 蛋白及mRNA 表達均明顯下調（P＜0.05）。見表1。

表1 谷氨酸對TRESK siRNA轉染大鼠脊髓神經元TRESK表達情況（）

表1 谷氨酸對TRESK siRNA轉染大鼠脊髓神經元TRESK表達情況（）

注：* 與空白組相比，P＜0.05；# 與Glu+NC siRNA 組相比，P＜0.05。

2.2 谷氨酸誘導神經元TRESK 中l(wèi)ncRNA 差異表達結果 本次實驗中共檢測lncRNA 基因經聚類分析得出，與Glu+NC siRNA 組比較，Glu+TRESK siRNA 組出現(xiàn)lncRNA 差異表達基因322 條，其中212 條基因表達上調，110 條基因表達下調。所有表達差異的lncRNA 基因中，uc007pgs.1 基因表達上調倍數(shù)最多，約為41.61 倍；而表達下調倍數(shù)最多基因為ENSMUST00000161848，約為6.97 倍。其中表達上調及下調差異倍數(shù)最大的前5 條lncRNA差異表達。見表2。

表2 Glu+NC siRNA組與Glu+TRESK siRNA組部分lncRNA基因差異表達

2.3 lncRNA 差異表達基因生物信息分析 GO 分析結果顯示，lncRNA 差異表達的靶基因功能更多與炎癥反應、凋亡過程及生物過程等有關，見圖1。KEGG 富集通路分析結果顯示，差異顯著的lncRNA 基因調控的靶基因主要參與mTOR 信號通路、蛋白激酶信號通路和GRCP 信號通路等下游通路，見圖2。

3 討論

圖1 GO富集分析

圖2 KEGG富集通路分析

神經病理性疼痛是臨床中常見慢性疼痛，其形成及病程發(fā)展機制或經多種神經遞質參與，發(fā)病機制較為復雜。文獻[5-6]報道，谷氨酸可誘導脊髓神經元TRESK 凋亡，且與慢性疼痛的發(fā)生機制密切相關。而神經病理性疼痛的病理過程涉及大量細胞分子的變化，許多研究證實了lncRNA 可調節(jié)編碼基因的表達，從而影響神經發(fā)育，且富集于大鼠中樞神經，密切參與許多神經系統(tǒng)性疾病[7-8]。因此，通過研究脊髓神經元TRESK 的變化及其lncRNA 差異表達情況，分析差異基因參與機制和信號通路分析，進一步闡明神經病理性疼痛的病理過程。

在本次研究中，大鼠脊髓神經元TRESK 經谷氨酸之后其mRNA 和蛋白表達量上調，TRESK siRNA 轉染后，Glu+TRESK siRNA 組相比較于Glu+NC siRNA 組，脊髓神經元的TRESK 蛋白及mRNA 表達明顯下調，說明谷氨酸對TRESK 具神經元突觸及功能調控作用，與文獻[9-10]研究報道結果相符。通過谷氨酸處理神經元TRESK 蛋白24 h之后的lncRNA 進行基因芯片高通量測序，以篩選差異倍數(shù)最大且差異顯著基因322 條，其中212 條基因表達上調，110 條基因表達下調，這些差異表達lncRNA 基因或與神經元TRESK 參與神經病理性疼痛的生物功能進程有關[11]。為進一步發(fā)掘lncRNA 顯著差異表達靶基因的潛在作用和效應功能，進行了GO 富集分析和KEGG 富集通路分析，其中當富集值越大是，其代表差異基因參與生物過程和涉及信號通路更密切[12-13]。結果在GO 富集分析中，差異顯著的靶基因更多富集于炎癥反應、凋亡過程及生物過程等，提示這些差異顯著的靶基因可促進分子結合與分化和信息傳導，當減少神經元凋亡可印制傷害信息傳導，致脊背根神經節(jié)向脊髓傳導痛覺傷害性神經元的興奮增高，進而產生痛覺反應，表明lncRNA 或參與神經功能行使[14-16]。KEGG 富集通路分析可以發(fā)現(xiàn)，PI3K-AKT 信號通路有許多功能，差異顯著的lncRNA 靶基因主要涉及mTOR 信號通路、蛋白激酶信號通路和GRCP 信號通路等下游通路，表明神經元TRESK 中差異表達的lncRNA 可能通過以上信號通路直接或間接參與神經病理性疼痛病程發(fā)展[17-20]。然而對于差異lncRNA 在上述信號通路的調控機制仍有待進一步研究，且本研究僅探討lncRNA 表達譜的差異，對于共表達的mRNA 在神經元TRESK 的生物學功能未深入展開分析。

綜上，谷氨酸誘導神經元TRESK 中相關lncRNA 表達譜發(fā)生差異，從而引起細胞炎癥反應和神經元凋亡，其中mTOR 信號通路、蛋白激酶信號通路和GRCP 信號通路可能是主要的靶點信號通路，以期為闡明臨床中神經病理性疼痛的發(fā)病機制提供理論性參考依據(jù)。