急性腹瀉患者的副溶血弧菌毒力及耐藥特征分析

佟世勝

副溶血弧菌是一種在各類海產中廣泛流行的重要病原菌，人們食用了未熟的水產品，極易引發胃腸道疾病，大多數食源性疾病都由此菌造成，也會引發食物中毒等嚴重疾病[1-3]，在全球范圍內都有其爆發感染的報道。副溶血弧菌感染主要侵犯人體的胃腸道，若有身體有破潰，也會造成傷口感染，嚴重的可侵入人體循環系統。胃腸道感染副溶血弧菌的患者癥狀表現為中重度腹瀉，伴有惡心、嘔吐及腹部絞痛，部分也可出現發熱和里急后重[4]。與副溶血弧菌相關的毒力因子有很多，目前臨床上較為熱點的是有關耐熱直接溶血素（thermostable direct he-molysin，TDH）、耐熱直接相關溶血素（TDH-related he-molxsin，TRH）和Ⅲ型分泌系統的研究[5]。過去的大量研究已經證實TDH、TRH 和TLH 三種溶血素對副溶血弧菌的致病性的影響，而它們的編碼基因已被確定為trh 和tdh 兩種[6]。Ⅲ型分泌系統近期受到眾多研究者的關注，目前的研究結果表明T3SS1 與細胞毒素有關，T3SS2 與腸毒素有關。本研究通過對68 例急性腹瀉患者的副溶血桿菌進行毒力基因檢測及耐藥性調查，分析其病原特征和耐藥特點，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）菌株來源：68 例副溶血弧菌分離自2019 年1-10 月本市腸道門診急性腹瀉患者的糞便樣本。（2）儀器與試劑：Vitek 2 Compact 全自動細菌鑒定儀（法國生物梅里埃公司），藥敏紙片（英國Oxoid 公司）。DNA Engine PCR 擴增儀（美國Bio-Rad 公司）。副溶血弧菌的毒力基因引物由上海生工生物技術有限公司合成。相關培養基和生化試劑購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 副溶血弧菌模板DNA 的提取 菌株分離標準參照《細菌性腹瀉臨床實驗室診斷操作指南》，將分離的副溶血菌株移至培養皿中，在恒溫37 ℃下培養過夜，在10 000 r/min 下離心5 min，除去上清液，后加入1 mL 生理鹽水，并震蕩防止細菌成團，重復上述離心工作；后向沉淀中加100 μL無菌蒸餾水重新震蕩懸浮后置100 ℃水浴10 min；13 000 r/min 離心10 min，上清即為PCR 擴增所用的模板DNA，置于低溫環境保存

1.2.2 毒力基因檢測 檢測副溶血弧菌tdh、trh、tlh 基因攜帶情況，檢測技術采用單重聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）。檢測T3SS1、T3SS2α 和T3SS2β 基因攜帶情況，技術選取多重PCR。引物送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列及反應條件，見表1。

表1 副溶血弧菌tdh、trh、tlh基因攜帶情況

1.2.3 藥物敏感性試驗 實驗菌株藥敏試驗選取于CLSI 推薦的Kirby-Bauer 紙片法。菌株轉種于血平板于溫度35 ℃經過夜培養后，添加0.85%氯化鈉溶液將菌液調整到合適濃度，后將菌液涂滿于培養基表面，最后在培養基表面覆蓋藥敏紙片，經恒溫孵育17 h 后對抑菌環直徑進行測量。選擇15 種抗生素進行研究，選用大腸埃希菌進行質控，參照CLSI M45-2016 的弧菌折點標準和CLSI M100-S26E的腸桿菌科折點標準。

1.3 觀察指標 副溶血弧菌感染的毒力基因、副溶血弧菌的藥物敏感性試驗結果。

2 結果

2.1 毒力基因分析 所有研究對象毒力基因tlh 全部顯示陽性，其中攜帶毒力基因tdh 的菌株有67 株，tdh 攜帶率為98.53%；2 株trh 陽性。65 株tdh（+）trh（-），2 株tdh（+）trh（+），1 株tdh（-）trh（-）。68 株副溶血弧菌均表達了T3SS1 基因，65 株tdh（+）trh（-）的菌株中有64 株表達了T3SS2α基因，2 株tdh（+）trh（+）的菌株中有1 株表達了T3SS2β 基因，其余菌株未發現。見表2。

表2 68株副溶血弧菌T3SS分布 株

2.2 藥物敏感性測試結果 副溶血弧菌對碳氫霉烯類抗生素的敏感性最高達100%，所有菌株對氯霉素、強力霉素、復方新諾明和碳氫霉烯類抗菌藥物（亞胺培南、美羅培南）敏感；90%以上的菌株對頭孢曲松、阿奇霉素和慶大霉素敏感；對氨芐西林耐藥率最高為86.8%，磺胺異噁唑耐藥率次之為67.6%。見表3。

表3 副溶血弧菌對16種抗生素的耐藥情況 例（%）

3 討論

副溶血弧菌在全世界均廣泛存在并流行，是經口引起疾病的重要菌，最主要是途徑是使用海產品，進而導致的胃腸炎[7]，在中國食源性疾病監測網報道的細菌性食源性疾病暴發疫情中，副溶血弧菌相關的中毒事件占總數1 060 起的29%[8]，多達308 起。在全球范圍內也有其爆發感染的報道。許多城市早年報道曾有感染副溶血弧菌的病例，短短幾年時間，感染人數上升至幾千人，未得到有效控制[9-10]。Mao等[11]借助文獻法推理演算出，因副溶血弧菌引發的食物中毒在中國每年約發生495.1 萬人次，繼而引發的急性胃腸炎在發達國家中出現率遠小于中國，但關于本病產生的醫療費用極高。副溶血弧菌感染人體后引起的相關疾病主要包括腹瀉、胃腸炎、傷口感染，嚴重可致敗血癥。被報道最多的相關疾病是食源性腹瀉。副溶血弧菌產生的毒力因子中，溶血素是目前受到了較多的關注和研究。在臨床和環境分離株中同時存在并有顯著的種屬特異性的基因是tlh 基因，在以前的認知中，tdh 基因編碼的TDH或trh 基因編碼的TRH 與副溶血弧菌的致病性有相關性。T3SS 由T3SS1 和T3SS2 組成，分別位于染色體1 和染色體2 上，其中T3SS2 由兩種亞型組成，分別是T3SS2α 和T3SS2β 兩種[12]，根據當前的研究結果可知，T3SS1 與細胞毒素存在聯系，T3SS2與腸毒素存在聯系。

一般情況下，實驗室分離株均可產生“神奈川現象”（kanagawa phenomenon，KP），出現一種特殊的血瓊脂上的β-溶血現象，即KP+，這種現象被認為與TDH 相關。紅細胞可以被TRH 與TDH溶解，且兩者均可以產生小動物致死腸毒素，兩者存在著相似的毒性作用。另外，大（chr I）、小（chr Ⅱ）2 條染色體在絕大部分副溶血弧菌中均可以被發現，每條染色體各自毒力基因編碼T3SS1 和T3SS2[12]。副溶血弧菌的T3SS 包括分泌裝置和效應蛋白，其中分泌裝置由多個結構蛋白組成，效應蛋白由分泌裝置分泌。T3SS1 的細胞毒性為主要作用，所有副溶血弧菌中均存在；KP+臨床分離菌株中發現絕大多數的T3SS2[13]。

TDH 是一種細胞毒素，同時作為一種蛋白質被染色體上的tdh 基因編碼，特征是溶血活性、細胞毒性和腸毒素活性[14]。本研究顯示，副溶血弧菌毒力基因tlh 全部呈現陽性的數量為68 株，具有顯著的種屬特異性；毒力基因tdh 陽性的數量為67 株，其攜帶率為98.5%，為證實副溶血弧菌最主要的致病因子是TDH 提供了證據。trh 基因編碼TRH，故可導致紅細胞溶解并產生小動物致死腸毒素，與其相近毒性的還有TDH。本研究中，出現2 株基因型表現為tdh（+）trh（+）的菌株，其trh 基因呈陽性，相關研究證據提示tdh（+）trh（+）基因型的感染性強于其他基因型[15]；而tdh（-）trh（-）的基因型在1 株菌株中出現，推測副溶血弧菌菌株中還可能存在除TDH 和TRH 外的獨立致病因子，但本結果未排除其他致病性細菌的混合感染導致的患病。業界一致認為，除TDH 與TRH 外，T3SS 同樣是潛在的與副溶血弧菌致病性相關的毒力因子[16]。副溶血弧菌的T3SS 包含由的效應蛋白通過Ⅲ型分泌系統分泌到宿主細胞，這一過程對宿主可產生致病性[17]。研究人員認識到副溶血弧菌含有2 套T3SS（T3SS1 和T3SS2），這一發現建立于該菌的全基因組測序[18]。T3SS1 位于染色體1 上，產生的細胞毒性介導細胞的自體吞噬，主要作用于宿主細胞，導致宿主細胞死亡。T3SS2 位于染色體2 的毒力島上，只存在于KP+的副溶血弧菌中。副溶血弧菌T3SS2 被證明不能同時但可攜帶tdh、T3SS2α 或trh、T3SS2β 基因。

本研究中，T3SS1 基因表達全部出現在68 株副溶血弧菌中，可借助T3SS1 基因特異性作為副溶血弧菌的鑒定菌株；tdh（+）trh（-）菌株中均攜帶T3SS2α 基因，菌株數達64 株，這一結果與國內其他相關研究報道的攜帶T3SS2α 基因的菌株，其攜帶的毒力基因tdh 也是陽性一致[19]。檢測發現僅tdh（+）trh（+）的菌株中存在T3SS2β 基因，表明trh（+）的存在與T3SS2β 的表達存在關聯。本研究結果表明，副溶血弧菌對氨芐西林和磺胺異噁唑的耐藥率分別達86.8%和67.6%，與蔡彥秋等[20]的研究結果相符，表明本研究分離的副溶血弧菌的耐藥性對這2 種抗菌藥物比較嚴重，臨床應對這一現象加以關注。本研究中，共24 株副溶血弧菌對鏈霉素和阿米卡星出現了一定程度的耐藥表現，而氯霉素、復方新諾明、強力霉素和碳氫霉烯類抗菌藥物（亞胺培南、美洛培南）的對本菌株的殺滅效果為100%。

綜上所述，針對感染性腹瀉患者，如已確定致病菌為副溶血弧菌，臨床在進行抗生素的選擇時，應以美羅培南或亞胺培南等碳氫霉烯類抗生素為首選，其次考慮應用頭孢曲松為代表的頭孢類藥物。