間歇性低氧預處理對心肌缺血損傷大鼠的心肌保護作用及其可能機制▲

陳依林 胡 克 李光才

(1 湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫院呼吸與危重癥科，恩施市 445000，電子郵箱：2766851633@qq.com；2 武漢大學人民醫院呼吸與危重癥科，湖北省武漢市 430000)

近年來，隨著人民飲食及生活習慣的改變，我國心肌缺血的發病率呈現持續上升的態勢，其不僅見于中老年人，也發生于部分20～30歲的年輕人[1-2]。心肌缺血損傷的發生，與心肌能量代謝障礙、氧自由基大量形成、細胞凋亡以及心肌血管內皮細胞損傷等因素均具有密切關系[3-4]。在正常情況下，機體可通過自身調節，實現血液供需的相對恒定，進而保證心臟的正常工作，但在多樣化因素影響下心肌血液供需出現失衡，可導致心肌缺血[5-6]。心肌缺血是心臟缺血性疾病常見的發病機制，由于心臟血液灌注顯著減少，使得心臟供氧、心肌能量代謝受到嚴重影響，心臟的正常工作無法得到有效支持。有學者發現，間歇性低氧可提升心臟對于缺氧、缺血的耐受性，具有一定的心臟保護效果，對于缺血性心臟病的治療和防控具有積極意義[7]。本研究旨在探討間歇性低氧預處理對心肌缺血損傷大鼠的保護作用，以及對轉錄因子核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2)表達水平的影響，為心肌缺血損傷的防控和保護提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取45只健康SD雄性大鼠(購自中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，許可證號：SCXK 20090002)，均為無特定病原體級別，鼠齡8～10周，體重(180.22±20.12)g。采取隨機數字表法將大鼠分為對照組、實驗1組和實驗2組，每組15只。入組大鼠的選取和應用均符合美國國家衛生研究院實驗動物護理和使用指南要求，本研究通過倫理委員會審查。

1.2 主要試劑及儀器 肌酸激酶同工酶(creatine kinase MB isoenzyme，CK-MB)試劑盒(國藥準字：T20020005)、谷胱甘肽試劑盒(國藥準字：H20030001)、丙二醛試劑盒(國藥準字：H20040003)均購自南京建成生物工程有限公司，辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG(國藥準字：S10870044)購自北京中杉金橋生物技術有限公司，全蛋白濃度測定標準品購自普利萊公司，兔抗小鼠Nrf2抗體(國藥準字：T20040002)購自Santa Cruz生物科技公司。Eclipse 80i顯微鏡購自日本尼康公司，顯微CT購自美國GE醫療集團，CMT4204材料測試儀購自深圳市銀飛電子科技有限公司，R-911全自動放免計數儀購自中國科技大學科技實業總公司，7160全自動生化儀購自日本日立公司。

1.3 模型構建方法 對照組大鼠為假手術組，使用絲線穿過大鼠左側冠狀動脈，但是不進行結扎，在尾靜脈注射生理鹽水(40 mg/kg)。實驗1組采用墊扎球囊法[8]構建心肌缺血損傷模型。實驗2組構建間歇性低氧模型后30 min再采用墊扎球囊法構建心肌缺血損傷模型。間歇性低氧模型構建方法[9]：首先將大鼠置于6%～8%的低氧環境2 min，之后實施3 min的氧合處置，每次5個循環，4次/d，連續進行14 d。

1.4 血清CK-MB、谷胱甘肽和丙二醛水平的檢測 在心肌缺血損傷模型建立2 h后，腹腔注射3%的戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠，麻醉起效后，經由大鼠腹部主動脈采集5 mL血液樣本，4℃下500 r/min離心15 min，離心半徑為6 cm。分離血清，靜置0.5 h后，再分別按照CK-MB、谷胱甘肽和丙二醛的檢測試劑盒說明書檢測各指標水平。

1.5 心肌組織Nfr2蛋白表達水平的檢測 采用免疫印跡法檢測Nfr2蛋白表達水平。完成采血后，將大鼠放至75%的乙醇中浸泡消毒。5 min后，在超凈工作臺上無菌狀態下逐層打開大鼠胸腔，暴露心臟，隨后將心包剪開，從升主動脈處剪下心臟，分離后放置于磷酸緩沖鹽溶液中，反復沖洗3～4次，確保心腔血液沖洗干凈，用眼科剪剪除左、右心房及右心室、室間隔和大血管，留存左心室，剝離心外膜和心內膜。取左心室組織放入含有200 μL裂解液(含苯甲基磺酰氟2 μL)的EP管中，用微量勻漿器于冰上迅速低溫勻漿；待組織充分裂解后，將勻漿液移至另一EP管中，4℃下12 000 r/min離心5 min，取上清，轉移到新EP管，標記后置于-80℃冰箱中保存備用。采用二喹啉甲酸法進行蛋白定量后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將蛋白質轉移至硝酸纖維素膜，加入含5%脫脂奶粉的TBS封閉緩沖液中，室溫放置1 h；加入特異性Nfr2抗體，在4℃孵育過夜，然后在室溫下孵育1 h，加二抗后利用底物顯色試劑盒進行顯影，最后掃描條帶。將β-肌動蛋白作為內參蛋白，測量目的條帶的A值，將目的條帶A值和β-肌動蛋白條帶A值的比值，作為轉錄因子Nfr2蛋白的相對表達水平。

1.6 統計學分析 使用SPSS 19.0軟件進行統計分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗，多組均數的比較采用方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組大鼠血清CK-MB、谷胱甘肽和丙二醛水平對比 實驗1組的血清CK-MB和丙二醛水平高于對照組，谷胱甘肽水平低于對照組(均P<0.05)；實驗2組的血CK-MB和丙二醛水平低于實驗1組，谷胱甘肽水平高于實驗1組(均P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠血清CK-MB、谷胱甘肽和丙二醛水平對比(x±s)

注：與對照組相比，*P<0.05，與實驗1組對比，#P<0.05。

2.2 3組大鼠心肌組織Nrf2蛋白相對表達水平對比 實驗1組的Nrf2蛋白相對表達水平低于對照組，而實驗2組的Nrf2蛋白相對表達水平高于對照組和實驗1組(均P<0.05)，見表2。

表2 3組心肌組織Nrf2蛋白相對表達水平對比(x±s)

注：與對照組相比，*P<0.05，與實驗1組對比，#P<0.05。

3 討 論

近年來，隨著生活質量的提高，我國的人民生活習慣發生了很大的變化，導致心血管疾病的發生率顯著上升，缺血性心臟病的發病人數明顯增加，加之人口老齡化問題的影響，缺血性心臟病的發病和治療情況較為嚴峻[10]。心肌缺血發病的影響因素較多，血壓下降、冠狀動脈阻塞以及主動脈供血減少，均可直接引發心臟供血下降，此外心瓣膜病、心肌病變以及血黏度的變化也會對心臟供血產生影響，其中冠狀動脈粥樣硬化是心肌缺血最為常見的病因。對于缺血性心臟病的患者，實施再灌注治療可取得較為顯著的效果，但是大部分患者受損的心肌仍并未得到有效修復，甚至還會發生更加嚴重的心肌損傷，如心肌梗死面積進一步增加等，這些不可逆的嚴重心肌損害病癥，嚴重影響患者的健康和生命[11]。因此，心肌缺血損傷的防控，逐漸成為近年來研究的重點內容之一。有學者指出，持續性的低氧對于機體會產生不同程度的損傷，但合理地利用間歇性低氧作用機制，可以有效保護心肌組織，即間歇性低氧適應[12]。

心肌缺血損傷包含原發性缺血損傷以及繼發性的再灌注損傷兩種主要類型，心肌損傷的最基本機制是心肌的缺血缺氧[13]。本研究構建了大鼠心肌缺血損傷模型，并觀察間歇性低氧預處理的心肌保護作用。丙二醛屬于活性多不飽和脂肪酸過氧化物降解的產物，其血清水平越高，表明心肌損傷的程度越嚴重；CK-MB是較為常用的心肌損傷標志物之一，可用于心肌損傷和壞死程度的評估；而谷胱甘肽作為組織細胞中重要的調節代謝劑與抗氧化劑，在調節機體自由基代謝方面發揮顯著作用。因此本研究采用這3種指標評價大鼠的心肌損傷情況。結果顯示，實驗1組的血清CK-MB和丙二醛水平高于對照組，谷胱甘肽水平低于對照組(均P<0.05)，提示模型大鼠心肌損傷嚴重；而實驗2組的血CK-MB和丙二醛水平明顯低于實驗1組，谷胱甘肽水平高于實驗1組(均P<0.05)，提示間歇性低氧預處理可以減輕心肌缺血大鼠心肌損傷程度，并可提高抗氧化因子谷胱甘肽的表達。

轉錄因子Nrf2是細胞氧化應激反應過程中的關鍵性因子之一，能夠與抗氧化反應元件因子產生協同作用，進而構成Nrf2-抗氧化反應元件(antioxidant response element,ARE)信號通路[14]。相關研究表明，Nrf2-ARE信號通路具有細胞保護功能，能夠在抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤、抗細胞凋亡以及抗炎性反應和神經保護方面發揮顯著的效果，還具有顯著且廣泛的機體抗氧化還原作用[15]。Nrf2能夠調節抗氧化應激，屬于細胞抗氧化還原中較為重要的轉錄因子，在Nrf2-ARE信號通路形成后，可清除細胞內氧自由基，上調多種抗氧化酶和解毒酶的表達，同時還能夠上調超氧化物歧化酶、谷胱甘肽以及多種抗氧化物質的表達水平，對維持細胞氧化還原平衡狀態的穩定具有顯著效果[16]。心肌氧化還原損傷最主要的表現是心肌缺血再灌注損傷，Nrf2屬于中樞轉錄因子，能夠在內源性抗氧化途徑中發揮顯著作用，同時對于Ⅱ相解毒酶以及抗氧化劑的表達，具有顯著的調節作用，因此可以作為心肌保護治療的一個靶點。本研究進一步檢測了大鼠心肌組織Nrf2蛋白表達水平，以探討間歇性低氧對心肌保護作用的可能機制。結果顯示，實驗1組的Nrf2蛋白相對表達水平低于對照組，而實驗2組的Nrf2蛋白相對表達水平高于實驗1組(均P<0.05)，這提示間歇性低氧預處理能夠促進心肌缺血損傷大鼠心肌組織Nrf2蛋白的表達。因此，我們推測間歇性低氧處理可以通過Nrf2-ARE信號通路，實現調節抗氧化應激的作用，進而促進谷胱甘肽等抗氧化因子的表達，從而實現對于心肌缺血損傷大鼠心肌的保護作用。

綜上所述，間歇性低氧預處理對心肌缺血損傷大鼠具有一定的心肌保護作用，并且這種保護作用可能與上調轉錄因子Nrf2的表達有關，但具體的作用機制還需要進一步深入研究。