糖尿病視網膜病變患者外周血微小RNA-181a與血管內皮生長因子水平及臨床意義▲

周永紅 周慧敏 康 巖

(1 河北省石家莊市婦幼保健院營養科，石家莊市 050050，電子郵箱：zhouyonghong8193@163.com；2 河北醫科大學第一醫院內分泌科，石家莊市 050023)

流行病學研究表明，有28.8%的糖尿病患者在發病5年以內發生糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)，而病程達15年以上者有77.8%發生DR[1]。DR患者有不同程度的視力障礙，當新生血管大量出血至玻璃體腔時，視力將完全喪失，對患者日常生活造成嚴重影響[2]。因此，DR的早期綜合防控將是未來研究的重點，尋找DR發生、發展的早期標志物，對DR的早期綜合防控具有重要意義。微小RNA是一類長度為19～25個核苷酸的內源性非編碼RNA分子，主要通過堿基互補與靶mRNA的3端非翻譯區結合，從而發揮調控基因表達的功能[3]。研究顯示，微小RNA在視網膜發育及病變過程中起到重要作用，可能成為潛在標志物[4]。有學者發現，微小RNA-181a可通過調控免疫細胞的增殖與分化，參與DR的發病[5]。血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是能特異性地促進血管內皮細胞生長的細胞因子，在視網膜缺血缺氧性病變的新生血管形成過程中起重要作用[6]。本研究探討DR患者微小RNA-181a與VEGF水平的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年6月至2018年6月河北醫科大學第一醫院收治的85例2型糖尿病患者。納入標準：(1)符合2010年美國糖尿病學會制定的2型糖尿病診斷標準[7]；(2)抽血前未接受眼部相關治療。排除標準：(1)有肝、腎等功能不全者；(2)出現2型糖尿病急性并發癥者；(3)神經、精神疾病患者，無法配合治療；(4)合并良性或惡性腫瘤者；(5)外傷所致視網膜病變。根據眼底檢查和眼底熒光血管造影結果，將患者分為無視網膜病變(non diabetic retinopathy,NDR)組49例與DR組36例。另選取同期至河北醫科大學第一醫院體檢的62例健康者為對照組。3組研究對象的臨床資料比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)，具有可比性，見表1。研究對象對本研究知情并簽署知情同意書。本研究經河北醫科大學第一醫院倫理委員會審核批準。

表1 3組研究對象的臨床資料比較

1.2 觀察指標

1.2.1 生化指標：抽取3組研究對象(患者于治療前、體檢者于體檢當日)清晨8:00空腹肘靜脈血3 mL，采用酶聯免疫比色法檢測空腹血糖、LDL-C，檢測儀器為日立7600型生化分析儀，相關試劑盒購自日立公司(批號：17012613、17121742)；采用離子交換高效液相色譜法檢測糖化血紅蛋白A1c(glycosylated hemoglobin A1c，HbA1c)，檢測儀器為D10全自動糖化血紅蛋白分析儀(美國Bio-Rad公司)，相關試劑盒購自美國Bio-Rad公司(批號：170428、180215)。

1.2.2 微小RNA-181a：于糖尿病患者入院次日、體檢者體檢當日,抽取其空腹肘靜脈血4 mL，置于3.2%枸櫞酸鈉1 ∶9真空抗凝管中放入離心機，在4℃下4 000 r/min離心15 min后放入空試管中備用。在血清標本中加入總RNA提取試劑(北京曠博生物技術有限公司，批號：170423)2 mL，提取總RNA，置于-20℃保存備用。將RNA反轉錄為cDNA。以U6為內參，采用ABI 7500型熒光定量PCR儀(美國應用生物系統公司)進行實時熒光定量PCR。反應條件為95℃預變性1 min，95℃變性30 s，58℃退火5 s，共30個循環，70℃延伸5 s。實驗重復3次。采用2-△△Ct法計算微小RNA-181a的相對表達水平。

1.2.3 VEGF：于糖尿病患者入院次日、體檢者體檢當日，抽取其清晨空腹肘靜脈血2 mL，加入乙二胺四乙酸抗凝，室溫下2 500 r/min離心15 min，取血漿，采用美國Bio-Tek全自動酶標儀(型號：800ELX)進行酶聯免疫吸附試驗，雙抗體夾心法檢測VEGF，試劑盒購自北京晶美生物工程公司(批號：170528)。

1.3 統計學分析 采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析。計數資料以例數或率表示，比較采用χ2檢驗；正態計量資料以(x±s)表示，比較采用t檢驗或單因素方差分析(多重比較采用SNK-q檢驗)；非正態計量資料以[M(P25，P75)]表示，多組采用Kruskal-WallisH檢驗進行分析，多重比較采用Nemenyi檢驗；采用Logistic回歸模型分析影響因素；相關性分析采用Pearson檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組生化指標、微小RNA-181a、VEGF水平比較 與對照組比較，NDR組、DR組中的空腹血糖、LDL-C、HbA1c、VEGF水平升高，微小RNA-181a相對表達水平降低(均P<0.05)，且DR組的空腹血糖、LDL-C、HbA1c、VEGF水平高于NDR組，微小RNA-181a相對表達水平低于NDR組(均P<0.05)，見表2。

表2 3組生化指標、微小RNA-181a、VEGF水平比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與NDR組比較，bP<0.05。

2.2 糖尿病患者視網膜病變影響因素Logistic回歸分析 以年齡(>53歲=1、≤53歲=0)、性別(男=1、女=0)、體質指數(>24.0 kg/m2=1、≤24.0 kg/m2=0)、LDL-C水平(>3.26 mmol/L=1、≤3.26 mmol/L=0)、HbA1c水平(>9.76 mg/dL=1、≤9.76 mg/dL=0)、微小RNA-181a相對表達水平(<2.48=1、≥2.48=0)、VEGF水平(>198.74 μg/L=1、≤198.74 μg/L=0)為自變量，以糖尿病患者是否合并DR為因變量(無=0、有=1)，進行Logistic回歸分析。結果顯示患者年齡>53歲、LDL-C水平>3.26 mmol/L、HBA1c水平>9.76 mg/dL、微小RNA-181a相對表達水平<2.48、VEGF>198.74 μg/L為DR的危險因素(均P<0.05)，見表3。

表3 糖尿病患者視網膜病變影響因素Logistic回歸分析

2.3 血清微小RNA-181a與年齡、VEGF、LDL-C、HbA1c的相關性 對照組中，微小RNA-181a相對表達水平與年齡及VEGF、LDL-C、HbA1c水平均無相關性(均P>0.05)；NDR組和DR組微小RNA-181a與年齡無相關性(均P>0.05)，與LDL-C、HbA1c水平呈正相關，與VEGF水平呈負相關(均P<0.05)，見表4。

表4 血清微小RNA-181a相對表達水平與年齡、VEGF、LDL-C、HbA1c的相關性

3 討 論

糖尿病患者的異常組織氧合作用，可引起微血管周圍細胞變性、基底膜增厚和內皮細胞增生，導致視網膜血管病變，最終使視網膜無血流灌注、血管通透性增加、血管病理性增生，從而破壞患者視功能，甚至致盲，嚴重影響患者的生活質量[8-9]。目前DR的發生機制尚未明確，有學者認為DR屬于慢性炎癥，微血管病變為主要病理基礎[10]。血清學指標簡單、快速，是以往臨床上診斷DR的實驗室常用指標之一。既往研究表明，微小RNA通過誘導細胞分化、觸發及調節炎癥反應參與DR的發生發展，此外VEGF水平與DR發展過程也密切相關[11-12]。

微小RNA通過降解mRNA或抑制其翻譯，來調控靶基因的表達，影響細胞增殖、分化、遷移和凋亡[13]。隨著分子生物研究的發展，有學者發現微小RNA參與新生血管的形成，通過轉錄后與VEGF mRNA的非翻譯區結合，降低VEGF mRNA穩定性來負調控VEGF的表達，減少新生血管的形成，這對DR早期預防有著重要意義。研究表明，微小RNA表達的改變與DR發病密切相關[11]。DR最主要特征是視網膜微血管病變、視網膜新生血管形成等，VEGF在其中發揮重要作用。VEGF是血管生長因子家族成員之一，其對視網膜色素上皮細胞高度特異性有絲分裂具有重要的調控作用，能夠刺激血管內皮細胞的分裂、增殖和趨化作用，使病變血管內皮細胞發生不同程度的遷移，增加視網膜微血管滲透性。VEGF與血管生長細胞表面VEGF受體結合，可誘導鈣離子釋放，破壞血-視網膜屏障，引起視網膜滲出、出血及水腫[14]。徐晨等[15]發現，VEGF-634C、VEGF-405G、VEGF-460C等水平升高與DR的病理生理過程有著密不可分的關系，能預測DR的發生。

本研究結果顯示，對照組、NDR組、DR組的空腹血糖、LDL-C、HBA1c、VEGF水平依次升高，微小RNA-181a相對表達水平依次降低(均P<0.05)，提示血清微小RNA-181a及VEGF或可成為DR的有效診斷指標。研究表明，微小RNA與VEGF在DR發生發展過程中發揮重要的作用，兩者可為DR的預防和靶向治療提供思路[16]。本研究結果顯示，微小RNA-181a相對表達水平<2.48及VEGF水平>198.74 μg/L均為2型糖尿病發生DR的危險因素(均P<0.05)，這與張莉等[17]的研究結果相似；此外，對照組的微小RNA-181a相對表達水平與血清VEGF水平均無相關性(均P>0.05)，而NDR組和DR組微小RNA-181a相對表達水平與VEGF水平呈負相關(均P<0.05)，這與吳心池等[18]的研究結果相似。這提示微小RNA-181a與VEGF密切相關，兩者的相互作用可能促進了DR的發生發展。因此，血清微小RNA-181a水平降低及VEGF水平升高可能是糖尿病患者出現視網膜病變的預警信號，臨床上應盡早采取有效的措施控制病情進一步發展[5,19]。

綜上所述，DR患者血清微小RNA-181a水平降低，而VEGF水平升高，兩者密切相關，其相互作用或在DR的發生發展中起重要作用。