藥對枳實-白芍配伍比例對肝郁脾虛型腸易激綜合征大鼠的藥效學研究

葉曉梅，王東明，袁康瑞，劉小柳，吳都督，陳 稚*（.廣東醫科大學藥學院，廣東東莞53808；. 廣東省深圳市羅湖區人民醫院醫學檢驗科，廣東深圳 5800）

腸易激綜合征 (irritable bowel syndrome，IBS)是一類臨床上常見的慢性胃腸道功能紊亂性疾病，以反復腹痛、腹部不適及排便習慣改變為特征，常伴有抑郁、焦慮等癥狀[1-2]。該病在全世界的患病率為1%～20%，嚴重影響患者的生活質量，造成了沉重的醫療負擔[3]。IBS發病機制尚未明了，其發病原因可能與內臟高敏感性、精神心理障礙、腦腸軸互動異常、腸道屏障受損、菌群失調、免疫異常等因素有關[4-7]。

目前對于該病臨床上并無特效藥，通常采用匹維溴銨片、比沙可啶、洛哌丁胺、低劑量阿米替林等進行對癥治療，但結果差強人意[8-9]。因此，需要進一步研究有效治療IBS的潛在新療法。

中醫上認為腸易激綜合征與肝脾腎功能失調有關，屬于“郁證”“腹痛”“便秘”和“泄瀉”等范疇，應以調和肝脾、疏肝解郁為主要治療原則[10]。枳芍散出自《金匱要略》，枳實歸脾、胃經，行氣滯，瀉滿除煩；白芍歸肝經，疏肝止痛；兩者配伍，可調和肝脾，兼顧氣血，既去腹痛，又除煩滿。研究表明，枳實白芍配伍，對產后腹痛、急性脘腹痛等腸道疾病具有治療作用，且兩者配伍比例不同，表現不同的藥效[11-13]。而對于枳實芍藥對治療腸易激綜合征尚未見文獻報道。

本研究采用乙酸灌腸、夾尾激怒加束縛應激的方法復制了肝郁脾虛型IBS大鼠模型，觀察了不同配比的枳實-白芍對IBS大鼠內臟敏感性、抗抑郁作用以及對鎮痛作用的影響，并篩選了枳實-白芍藥對治療肝郁脾虛型IBS的最佳配伍比例。為枳實-白芍藥對治療肝郁脾虛型腸易激綜合征的合理性和科學性提供實驗支持，并對其臨床應用提供參考與指導。

1 材料和方法

1.1 藥材與試劑

枳實(產地江西新干，批號110220)，白芍(產地安徽，批號YPA2B0001)，均從廣州致信中藥飲片有限公司購買。

匹維溴銨片(法國Abbott Products SAS公司，批號624757)、阿司匹林片(江蘇恩華藥業股份有限公司，批號20120206)、氯化鈉注射液(國藥集團榮生制藥有限公司，批號12120342)、乙酸(天津市四友精細化工品有限公司，批號130742)

1.2 實驗動物

SPF級SD種大鼠，雌雄各半，身體質量200～220 g，動物許可證號：SCXK(粵)2008-0002；SPF級KM種小鼠，雌雄各半，身體質量18～22 g，動物許可證號：SCXK(粵)1032018。以上動物均由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供。

1.3 實驗儀器

Sartorius LIBROR AEG-220電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)、導尿管(廣州文瑞醫療器材有限公司)、壓力表(北京醫療設備廠)。

1.4 實驗方法

1.4.1 建立肝郁脾虛型IBS動物模型 將48只SPF級SD大鼠隨機分成8組，每組6只，分別為正常組、IBS模型組、陽性組(匹維溴銨組)、白芍組、枳實組、枳實-白芍1:1組，枳實-白芍1:2組，枳實-白芍2:1組。分籠適應性飼養1周，正常組以普通飼料喂養，其他大鼠采用乙酸灌腸、夾尾激怒和束縛應激的方法造模3周，以制備肝郁脾虛型IBS模型。依據文獻[14-16]對模型講行評價。

1.4.2 制備藥物 設計枳實-白芍1:1、1:2、2:1(質量比，下同)3個不同配比組[13]，稱量藥物溶于6倍體積的蒸餾水；武火加熱至沸騰并持續沸騰30 min，趁熱過濾；濾液烘干至質量恒定，即得干浸膏，計算煎出率。使用蒸餾水配制2.5 g/L的匹維溴銨溶液和30 g/L的阿司匹林溶液作為陽性組用藥。

1.4.3 分組給藥 正常組模型組均以生理鹽水灌胃；陽性組：匹維溴銨溶液(0.025 g/kg)或阿司匹林溶液(0.3 g/kg)灌胃；藥物組：灌胃劑量為6 g/kg(生藥量，其中鎮痛實驗劑量為9 g/kg)，每天給藥1次，連續7 d(鎮痛實驗每天給藥1次，連續3 d)。

1.4.4 腹部回縮反射實驗 末次給藥后60 min，待大鼠麻醉后，將擴張球囊插入結直腸內(深度約為5 cm)，固定大鼠尾巴的根部，待其穩定后，將其置于能限制其肢體運動而不影響呼吸的透明束縛器內。30 min后，分別施加20、40、60、80 mmHg的分級壓力，每級壓力維持20 s，施壓間隔為5 min，重復3次。響應AWR 評分標準參照Al-Chaer[17]方法。

1.4.5 曠場實驗 曠場實驗箱規格為80 cm×80 cm×50 cm，內分為等面積的25個方格，正中格上方安置攝像頭。實驗環境安靜，室內亮度與動物房夜間亮度一致，實驗均在早上9:00開始以減少生物節律的影響。將大鼠先置于測試室10 min以適應環境，將大鼠輕放入實驗箱正中，并記錄大鼠3 min內的活動。曠場實驗總得分為水平得分和垂直得分之和。水平得分為大鼠越過的方格數(四爪均進入)，垂直得分為直立次數。曠場實驗總得分反應了大鼠的興奮程度。另外，還需記錄中央格停留時間和修飾次數如前肢理毛、抓癢、洗臉以及舔足等。每次實驗結束徹底清掃曠場箱。得分基于2人的觀察結果的平均值。

1.4.6 鎮痛實驗 分組如上，KM種小鼠實驗前禁食12 h，末次給藥 30 min 后，腹腔注射 0.6%乙酸溶液0.1 mL/10 g，記錄各小鼠20 min內扭體反應次數，并計算其抑制率。扭體反應抑制率的計算公式為：

1.5 統計學處理

應用SPSS 20.0統計軟件進行分析，采用單因素方差分析，如方差齊性選用LSD分析方法，如方差不齊選用Dunnett’s T3分析方法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 枳實、白芍及其不同比例對模型大鼠腸道敏感性的實驗結果

以動物腹部回縮反射(AWR)來評價動物的內臟敏感性[18]。由表1可見，模型組在不同的擴張壓力下AWR評分均明顯比正常組高，內臟敏感性均明顯升高(P<0.01或0.05)；與模型組比較，白芍組、枳實組和枳實-白芍1:2組內臟敏感性降低，但高于陽性組；枳實-白芍1:1、枳實-白芍2:1組能明顯降低內臟敏感性(P<0.01或0.05)，且作用與陽性組相當。

2.2 枳實、白芍及其不同配伍比例對模型大鼠曠場行為學的影響結果

由表2可見，與正常組比較，模型組大鼠的總行為次數明顯減少(P<0.01)，中央區域停留時間明顯增加(P<0.05)，與中醫所說的“肝郁”相符。給藥后，各給藥組均能不同程度地改善抑郁狀態。其中白芍組總行為次數得分最高，中央區域停留時間最短，抗抑郁作用最好，可能是由于白芍柔肝止痛作用的原因。而在枳實-白芍藥對的不同配比中，枳實-白芍1:1組和枳實-白芍1:2組中央區域停留時間較短，表明其抗抑郁作用較好，尤其以枳實-白芍1:1組最好。另一方面，各組大鼠的修飾次數差異不大。

2.3 枳實、白芍及其不同配伍比例對模型小鼠鎮痛的影響研究

由表3可見，與正常組比較，除枳實組對醋酸誘發的小鼠扭體次數無明顯作用外，其余各組均能明顯減少小鼠的扭體次數(P<0.01或0.05)。而白芍組和枳實-白芍1:1組對醋酸誘發的小鼠疼痛有顯著的抑制作用，特別是枳實-白芍1:1組與阿司匹林組的抑制率接近，與枳實-白芍2:1組、枳實-白芍1:2組比較差異有統計學意義(P<0.01)，表明在枳實-白芍不同配比組中，枳實-白芍1:1組抑制小鼠的痙攣疼痛作用最強。

表1 對IBS模型大鼠在不同壓力下的AWR評分比較 (±s，n=6)

表1 對IBS模型大鼠在不同壓力下的AWR評分比較 (±s，n=6)

與正常組相比：aP<0.01，bP<0.05；與模型組相比：cP<0.01，dP<0.05

組別正常組模型組匹維溴銨組白芍組枳實組枳實-白芍1:1組枳實-白芍2:1組枳實-白芍1:2組劑量/(g/kg)20 mmHg 40 mmHg 60 mmHg 80 mmHg－ －0.41±0.49d1.59±1.05b0.25d6 6 6 6 6 0.51±0.21 1.23±0.74 0.72±0.62d0.44±0.33d0.34±0.35d0.67±0.39d0.68±0.61c1.97±0.96d2.78±0.98c2.65±1.02a3.45±1.12d4.01±0.17a0.79±0.31cdd2.06±0.63b1.85±0.78b2.06±0.72 2.85±0.51 2.71±0.46 3.01±0.32 3.53±0.52 3.61±0.49 1.45±0.31d1.81±0.55c2.65±0.71c1.53±0.65d2.01±0.52dc1.81±0.53b2.11±0.50d2.73±0.42 3.27±0.59

表2 對IBS模型大鼠曠場行為的影響 (±s，n=6)

表2 對IBS模型大鼠曠場行為的影響 (±s，n=6)

與正常組相比：aP<0.01，bP<0.05；與模型組相比：cP<0.01，dP<0.05；枳實-白芍不同配比組中，與枳實-白芍1:1組相比：eP<0.05；與枳實-白芍2:1組相比：fP <0.05

組別正常組模型組匹維溴銨組白芍組枳實組枳實-白芍1:1組枳實-白芍2:1組枳實-白芍1:2組劑量/(g/kg)總行為次數 中央區域停留時間/s－ －67.78±19.15c1.01±0.83d25.98±10.01 0.25 6 6 6 6 6 a 20.56±15.01bd37.05±26.07a57.71±36.14 45.52±10.031.41±1.01d36.93±8.56 37.35±11.83 b 29.05±13.38a3.09±2.45df31.00±10.59 43.10±3.95 a修飾次數4.15±1.82 3.34±1.31 4.23±2.84 3.54±1.91 2.05±1.87 3.15±2.01 3.40±1.96 4.03±3.21 21.59±4.08be4.51±2.56df

表3 對小鼠扭體反應的影響 (±s，n=6)

表3 對小鼠扭體反應的影響 (±s，n=6)

與正常組相比：aP<0.01，bP<0.05；與阿司匹林組相比：cP<0.01；枳實-白芍不同配比組中，與枳實-白芍1:1組相比：dP<0.01，與枳實-白芍2:1組相比：eP<0.01

扭體反應次數組別正常組阿司匹林組白芍組枳實組枳實-白芍1:1組枳實-白芍2:1組枳實-白芍1:2組劑量/(g/kg)－0.3 61.10±8.31c25.30±4.65a9 9 9 9 9 32.20±6.99a59.90±9.07c27.70±7.90ae48.80±7.91bcd42.70±6.74acd抑制率/%-58.59 47.29 1.96 54.66 20.13 30.11

3 討論

肝郁脾虛型IBS大鼠模型是一種以腹痛、腹瀉為主要特征，具有“肝郁脾虛證”的非器質性疾病模型。肝郁脾虛型IBS大鼠模型有多種造模方法，如母嬰分離、乙酸刺激加束縛應激法；乙酸灌腸加夾尾刺激法；饑飽失常、番瀉葉灌胃加強迫游泳法；新生母子分離、慢性束縛加番瀉葉灌胃法等；然而到目前為止還沒有公認的理想的造模方法。本研究采用乙酸灌腸、夾尾激怒加束縛應激的方法來制備肝郁脾虛型IBS大鼠模型。腸道灌注乙酸能模擬IBS腹痛及排便異常癥狀；夾尾激怒和束縛應激不僅可以造成內敏高壓性，也是模擬“肝郁脾虛證”最常采用的方法之一，符合“肝郁久犯脾，可導致脾虛”的情志致病理論。采用乙酸灌腸、夾尾激怒加束縛應激的方法建立的肝郁脾虛型IBS大鼠模型，表現出高內臟敏感性、抑郁和肝郁脾虛等多種特征，能很好地復制肝郁脾虛型IBS的臨床癥狀[19-22]。

本研究建立了肝郁脾虛型IBS大鼠模型，可從以下3個方面進行評價。(l)行為學評價：造模期間，模型組較空白組淡漠，扎堆，嗜睡；毛發蓬亂，大便稀，肛門周圍臟；納呆少食，身體質量下降。(2)IBS病的評價：內臟高敏感是造成腹部癥狀的主要原因，內臟敏感性增加是肝郁脾虛型IBS大鼠模型是否成功建立的關鍵指標。而模型組大鼠動物腹部回縮反射評分增加，表明其內臟敏感性增加。(3)肝郁脾虛證的評價：采用曠場行為學指標評價肝郁脾虛證的建立，模型組大鼠的曠場總行為次數和修飾次數均明顯減少，表現出抑郁狀態。從結果可見，模型大鼠具有肝郁脾虛和抑郁等中醫癥候，本實驗造模成功。

枳芍散由枳實芍藥二味組成，枳實通氣消食，可治氣滯之脹痛；芍藥補脾養肝，可治虛性腹痛；二者配伍，可走可守，攻補兼施。據報道，枳實具有調節胃腸蠕動、中樞鎮痛等作用；芍藥具有保肝、鎮痛、抗抑郁等作用[23]。本研究發現，枳實-白芍藥對對肝郁脾虛型IBS模型大鼠有較好的治療作用，藥效學評價如下：(l)枳芍藥對組AWR評分降低，能夠改善模型大鼠的腸道敏感性；(2)增加模型大鼠的自發行為，產生抗抑郁作用；(3)對醋酸等化學因素導致的疼痛具有抑制作用。同時發現枳實-白芍藥對能協同增強其治療肝郁脾虛型IBS模型大鼠的作用，且枳實-白芍1:1為最佳的藥效配伍比例，這也和古方枳芍散(來源于《金匱要略》)中的比例吻合，為發揮枳實-白芍藥對治療肝郁脾虛型IBS的療效及其臨床應用提供科學依據。