白藜蘆醇通過激活PI3K/Akt通路抑制心肌梗死大鼠細胞線粒體凋亡的作用研究

張顯純 王 琳 楊 帆

心肌梗死患者缺血-再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)后出現(xiàn)的心肌細胞凋亡是引起心肌損傷的主要機制之一，線粒體凋亡途徑的激活可誘導心肌細胞損傷，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)是調(diào)節(jié)缺氧或損傷下細胞凋亡的重要通路[1-2]。白藜蘆醇是一種天然存在的多酚物質(zhì)，近年來發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇具有抑制心肌細胞凋亡和減少缺血后心肌細胞損傷的作用[3]。但是，關(guān)于其保護心肌細胞機制的研究較少，最新的臨床研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合白藜蘆醇可提高對心肌梗死的治療效果[4]。本研究旨在分析白藜蘆醇通過抑制心肌梗死大鼠細胞凋亡的機制，為白藜蘆醇應(yīng)用于急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑、儀器和材料

選用45只成年SD大鼠(南京金陵醫(yī)院)，雄性，220～250 g。ELISA試劑盒和TUNEL凋亡試劑盒(武漢華美公司)。Model 680型酶標儀(美國Bio-Rad公司)。B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、細胞死亡調(diào)解子(Bcl-2 interacting mediator of cell death，BIM)、Bcl-2相關(guān)蛋白X(Bcl-2-associated X protein，BAX)、半胱天冬酶3(Caspase3)和半胱天冬酶9(Caspase9)引物由蘇州Genewiz公司設(shè)計和合成。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒TaKaRa和SYBR Prellix Ex TaqTM實時聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒購自日本TaKaRa公司。anti-PI3K，anti-Akt，anti-p-PI3K，anti-p-Akt以及相關(guān)二抗均購自美國Abcam公司。聚偏二氟乙稀(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(美國Bio-Rad公司)。

1.2 建模及干預方法

將45只SD大鼠隨機分為對照組、模型組和白藜蘆醇組，每組15只。

(1)心肌梗死大鼠模型建立方法為:將大鼠使用4%的水合氯醛麻醉，氣管插管(潮氣量20 ml/kg，呼吸頻率50次/min)并連接心電圖，隨后迅速打開胸腔暴露心臟，使用6/0線在左心耳下約2 mm處的冠狀動脈前降支結(jié)扎，顯示心電圖QRS波增寬為結(jié)扎成功，45 min后取出絲線再灌注120 min，至心電圖QRS波恢復，關(guān)閉并縫合。

(2)對照組大鼠僅打開胸腔，在冠狀動脈前降支結(jié)扎前1 min舌靜脈注射生理鹽水。

(3)白藜蘆醇組大鼠在冠狀動脈前降支結(jié)扎前1 min經(jīng)舌靜脈注射白藜蘆醇，劑量為20 mg/kg。術(shù)后采集小鼠靜脈血以及心臟組織進行后續(xù)的研究。

1.3 實驗方法

1.3.1 酶聯(lián)免疫吸附法

通過檢測大鼠心肌酶指標判斷心肌細胞損傷情況。將血液靜置后離心，以2000 r/min離心10 min，使用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測大鼠血清樣本中肌鈣蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)和肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme-MB，CK-MB)水平。根據(jù)說明書加入酶標記試劑和顯色劑，并通過加入終止溶液終止反應(yīng)。

1.3.2 細胞凋亡與聚合酶鏈反應(yīng)

(1)細胞凋亡。通過TUNEL凋亡試劑盒檢測凋亡率，按照試劑盒說明書操作并在熒光顯微鏡下觀察。

(2)實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative realtime-polymerase chain reaction，qRT-PCR)。qRTPCR法用于檢測心肌組織中信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mRNA)水平，組織裂解后收集總mRNA，在95 ℃下激活DNA聚合酶5 min進行PCR，進行40個循環(huán)的95 ℃、10 s和60 ℃、30 s兩步PCR，最終延伸75 ℃下10 min，保持在4 ℃，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內(nèi)部參照物，使用比較循環(huán)閾值法(2-ΔΔCT)分析RNA水平。

1.3.3 免疫印跡(Western blot)法

取對數(shù)生長期的bcl-2細胞，按2×106個細胞/培養(yǎng)皿接種bcl-2細胞。加入含終濃度為2.5 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L異土木香內(nèi)酯的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞48 h，離心收集細胞，使用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌細胞后，加入上樣緩沖液100 μl，劇烈振蕩后冰浴下超聲波處理1 min。100 ℃加熱10 min使蛋白質(zhì)變性，以12000 r/min離心10 min，取上清液測定蛋白濃度。取50 μg蛋白在SDS-PAGE電泳下分離，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，用5%脫脂奶粉于室溫下?lián)u動封閉膜2 h。棄封閉液，用1×TBS-T洗膜3次，每次15 min。膜在抗p53多克隆抗體(1∶500)和抗Bax多克隆抗體(1∶700)稀釋液中室溫過夜孵育，1×TBS-T洗膜15 min，共3次后，在二抗稀釋液(抗鼠1∶5000)中孵育40 min。再次洗膜后加入增強化學發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑，反應(yīng)1 min，用X光片曝光1～10 min后顯影。

在液氮的保護下裂解組織，離心(12000 r/min，15 min)后收集上清液，使用10%的SDS-PAGE凝膠用于電泳，電泳后使用PVDF膜轉(zhuǎn)膜并在室溫下用5%無脂牛奶封閉2 h。加入一抗，室溫振蕩2 h，后在4 ℃孵育過夜，加入二抗。使用GAPDH作為內(nèi)部參照物。

1.4 觀察指標

(1)ELISA檢測大鼠血清樣本后，使用酶標儀檢測并計算大鼠血清cTnT和CK-MB水平濃度。

(2)Western blot檢測PI3K、p-PI3K、AKT以及p-AKT蛋白的水平，并計算p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的值，分析PI3K和AKT蛋白磷酸化水平。

(3)TUNEL凋亡試劑盒檢測凋亡率，正常細胞的細胞核呈現(xiàn)藍色熒光，凋亡細胞的細胞核顏色偏白并且呈聚集狀態(tài)。

(4)觀察白藜蘆醇對線粒體凋亡相關(guān)蛋白，包括Bcl-2、BIM、BAX、Caspase3和Caspase9的mRNA水平的影響。

1.5 統(tǒng)計學方法

使用SPSS19軟件對所有實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均值±標準偏差表示，通過單因素方差分析(ANOVA)檢驗組間差異，組間兩兩比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠心肌酶水平比較

模型組大鼠血清cTnT和CK-MB水平與對照組相比顯著升高，其差異有統(tǒng)計學意義(t=34.587，t=24.987；P＜0.05)；白藜蘆醇組大鼠血清cTnT 和CK-MB水平顯著低于模型組，其差異有統(tǒng)計學意義(t=27.129，t=14.971；P＜0.05)，見表1。

表1 三組cTnT 和CK-MB水平比較

2.2 三組大鼠心肌細胞凋亡情況比較

模型組大鼠的心肌細胞凋亡率顯著升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(t=38.971，P＜0.05)；白藜蘆醇組大鼠心肌細胞凋亡率顯著低于模型組，其差異有統(tǒng)計學意義(t=12.687，P＜0.05)，見表2和圖1。

表2 三組大鼠心肌細胞凋亡情況比較

圖1 TUNEL法檢測三組大鼠心肌細胞凋亡情況(×50)

2.3 白藜蘆醇對p-PI3K/Akt通路的影響

建模后大鼠心肌細胞中的p-PI3K/PI3K通路被顯著抑制，模型組與對照組相比和白藜蘆醇組與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(t=21.927，t=16.541；P＜0.05)，而白藜蘆醇可顯著促進p-PAk/Akt通路活化，模型組與對照組比較和白藜蘆醇組與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(t=25.314，t=24.876；P＜0.05)，見表3和圖2。

表3 白藜蘆醇對大鼠心肌組織中PI3K/Akt通路的影響

表4 白藜蘆醇對線粒體凋亡相關(guān)基因mRNA水平的影響

圖2 Western blot檢測各組大鼠心肌組織中PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白的表達水平

2.4 白藜蘆醇對線粒體凋亡相關(guān)基因mRNA水平的影響

建模后大鼠心肌細胞BIM、BAX、Caspase9以及Caspase3的mRNA水平上調(diào)，而Bcl-2mRNA水平下調(diào)，白藜蘆醇可顯著抑制BIM、BAX、Caspase9及Caspase3基因表達，并促進Bcl-2基因表達，見表4。

3 討論

AMI是指由于冠狀動脈急性缺血引起的心肌梗死，具有發(fā)病急、進展快等特點，具有極高的病死率，且預后差異大，對患者生活和生命造成極大威脅[5]。心肌梗死是最常見的急性心臟損傷的原因之一，雖然近年來對心肌梗死的治療有所改善，然而心肌梗死后血液再灌注導致大量心肌細胞的缺血性死亡的情況仍難以緩解，因此減少I/R對心肌細胞的損傷在臨床治療心肌梗死和提高預后中具有重要意義[6]。

白藜蘆醇具有多種生化和生理作用，包括抗血小板、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡和抗炎作用，并具有保護心肌細胞改善心臟功能的作用[7]。為進一步分析白藜蘆醇對心肌I/R大鼠的影響，本研究建立了大鼠I/R模型，建模后大鼠血清中cTnT和CK-MB水平顯著升高，提示建模后心肌細胞受到損傷，cTnT和CK-MB外流至外周血中，而白藜蘆醇具有保護I/R后心肌細胞損傷的作用。進一步的分析顯示建模后大鼠心肌細胞凋亡率顯著升高，而白藜蘆醇干預后可顯著抑制心肌細胞凋亡。國內(nèi)有研究顯示，白藜蘆醇可保護I/R后的心臟損傷[8]。林巖等[9]通過體外細胞實驗也發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以抑制腎上腺素誘導的心肌細胞的凋亡，提示在體內(nèi)或體外，白藜蘆醇可以減少I/R后心肌細胞損傷抑制細胞凋亡的作用。

為進一步分析白藜蘆醇抑制I/R后心肌細胞凋亡減輕心肌細胞損傷的機制，本研究分析了其對PI3K/Akt通路和線粒體凋亡相關(guān)基因表達水平。PI3K/Akt是調(diào)控細胞凋亡的重要通路，已有研究顯示，在心肌細胞缺血或I/R后，PI3K/Akt通路被抑制，而線粒體凋亡可通過PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)，參與I/R后心肌細胞凋亡[10-11]。本研究結(jié)果顯示，建模后心肌細胞中的PI3K/Akt通路被顯著抑制，而白藜蘆醇可顯著促進PI3K/Akt通路活化，白藜蘆醇可顯著抑制BIM、BAX、Caspase9及Caspase3基因表達并促進Bcl-2基因表達。Pei等[12]研究結(jié)果顯示，提高PI3K/Akt通路具有保護心肌細胞損傷的作用。Colleen等[13]研究認為，PI3K/Akt途徑是黃酮保護心肌細胞I/R損傷所必需的通路。Zhang等[14]報道，白藜蘆醇具有上調(diào)PI3K/Akt途徑的作用，Wu等[15]的研究也得到了相似的結(jié)果。黃新宇等[16]報道，白藜蘆醇可通過上調(diào)Nrf2/ARE通路抑制心肌細胞I/R后炎性和氧化應(yīng)激損傷。此外，也有研究顯示，白藜蘆醇還可通過其他方式保護心肌細胞[17]。提示白藜蘆醇可能通過促進PI3K和Akt磷酸化抑制線粒體凋亡途徑，但是關(guān)于白藜蘆醇保護I/R的其他機制還需要進一步研究。

白藜蘆醇通過激活PI3K/Akt通路抑制心肌梗死大鼠細胞線粒體凋亡，并減少I/R引起的心肌細胞損傷。然而，關(guān)于白藜蘆醇治療心肌梗死及I/R的效果和具體機制還需要進一步研究。